乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达与患者病理特征和预后的关系

杨金珠，沈磊，宋琪，朱弘艳

1合肥市第三人民医院肿瘤科，合肥 230022；2安徽省妇幼保健院乳腺外科

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，2020年我国乳腺癌发病率和病死率分别居女性恶性肿瘤第1位和第5位，给女性的生命健康构成严重威胁［1］。因此，有必要找到早期预测乳腺癌患者预后的指标。微小RNA（miRNA）是一种小RNA分子，近年研究表明，其参与肿瘤发生、发展［2］。研究报道，miR-216a-5p在食管癌、子宫内膜癌中低表达，与癌细胞增殖、迁移、侵袭有关［3-4］。肿瘤发生、发展过程中存在多种转录共激活因子激活，甲状腺激素受体相互作用蛋白4（TRIP4）是转录共激活因子丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白1（ACS-1）的一个亚基，研究报道，其与黑色素瘤进展有关［5］。目前，miR-216a-5p、TRIP4在乳腺癌中的作用尚不明确。本研究分析乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达及与患者病理特征和预后的关系，旨在为早期评估乳腺癌患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2018年1月—2019年5月于合肥市第三人民医院及安徽省妇幼保健院就诊的85例乳腺癌患者临床资料，年龄29～68（44.18±9.87）岁；肿瘤直径：≥5 cm 31例，＜5 cm 54例；病理类型：浸润性乳腺癌25例，非浸润性乳腺癌60例；组织分化程度：低分化32例、中高分化53例；人表皮生长因子受体-2（HER-2）：过表达（免疫组化＞30%的浸润性癌细胞呈现强且完整均匀的细胞膜着色）17例，低表达68例；Ki-67增殖指数：高增殖指数（免疫组化阳性率≥20%）22例，低增殖指数（免疫组化阳性率＜20%）63例；TNM分期［6］：Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ期28例；有淋巴结转移30例。纳入标准：①经病理检查确诊为乳腺癌；②初诊且入院前未接受任何抗肿瘤治疗；③患者及家属均知情研究，并签署知情同意书；④接受保乳手术或乳房切除术。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②临床资料不完整或者中途失访者；③合并全身感染性疾病。本研究经医院伦理委员会批准（2019伦理234号）。

1.2 癌及癌旁组织中miR-216a-5p、TRIP4表达检测收集术中切除部分癌组织和癌旁组织（保乳手术距离癌组织＞3 cm，乳房切除术距离癌组织＞5 cm），液氮冷冻研磨后使用TRIzol试剂盒提取组织RNA，TaKaRa试剂盒反转录合成cDNA，Narodrop验证cDNA浓度及纯度，使OD260/OD280为1.8～2.0。SYBR Green Master Mix qRT-PCR试剂盒检测组织中miR-216a-5p、TRIP4表达。miR-216a-5p正向引物：5＇-GGGTAATCTCAGCTGGCAA-3，反向引物：5＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇；内 参U6正 向 引 物：5＇-GGCACCCAGCACAATGAA-3＇；反 向 引 物：5＇-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3＇。TRIP4正向引物：5＇-GGACUAGAGUUCAACUCAUTT-3＇，反向引物：5＇-AUGAGUUGAACUCUAGUCCTT-3＇；内参β-actin正向引物：5＇-ATCACCATTGGCAATGAGCG-3＇；反向引物：5＇-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3＇。反应体系共20µL：cDNA 2µL、正反向引物各1µL、2×Taq Master 10µL、双蒸水6µL；反应条件：95℃2 min、95℃30 s、62℃30 s、72℃30 s共循环40次。采用2-ΔΔCt法计算miR-216a-5p、TRIP4相对表达量。

1.3 随访患者出院后通过门诊或电话方式随访3年，统计术后3年无进展生存率（治疗后至肿瘤进展或任何原因死亡或随访截止）和3年总生存率（治疗后至任何原因死亡或随访截止）。

1.4 统计学方法采用SPSS26.0统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验；采用Pearson相关性分析乳腺癌组织中miR-216a-5p与TRIP4表达的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌及癌旁组织中miR-216a-5p、TRIP4表达比较乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4相对表达量分别为0.430±0.109、1.886±0.388，癌旁组织中分别为1.012±0.166、1.023±0.171，乳腺癌组织中miR-216a-5p表达低于癌旁组织，TRIP4表达高于癌旁组 织（t分别为26.954、18.743，P均＜0.05）。

2.2 乳腺癌组织中miR-216a-5p与TRIP4表达的相关性Pearson相关性分析显示，乳腺癌组织中miR-216a-5p与TRIP4表 达 呈 负 相 关（r=-0.637，P＜0.05）。

2.3 乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达与患者临床病理特征的关系乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达与患者HER-2表达、Ki-67增殖指数、TNM分期、淋巴结转移有关（P均＜0.05），与年龄、肿瘤直径、病理类型、分化程度、雌激素受体、孕激素受体无关（P均＞0.05）。见表1。

表1 乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达与患者临床病理特征的关系

2.4 乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达与患者无进展生存期和总生存期的关系随访6～36个月，85例乳腺癌患者3年无进展生存率和总生存率分别为71.76%（61/85）、83.53%（71/85）。以乳腺癌组织中miR-216a-5p、TRIP4表达均值为基准分为miR-216a-5p高表达组（≥0.430）44例、miR-216a-5p低表达组（＜0.430）41例、TRIP4高表达组（≥1.886）42例和TRIP4低表达组（＜1.886）43例，miR-216a-5p高表达组3年无进展生存率和总生存率分别为81.82%（36/44）、93.18%（41/44），miR-216a-5p低表达组分别为60.98%（25/41）、73.17%（30/41），miR-216a-5p高表达组3年无进展生存率和总生存率与miR-216a-5p低表达组比较差异均有统计学意义（χ2分别为4.550、6.177，P均＜0.05）；TRIP4高表达组3年无进展生存率和总生存率分别为61.90%（26/42）、71.43%（30/42），TRIP4低表达组分别为81.40%（35/43）、95.35%（41/43），TRIP4高表达组3年无进展生存率和总生存率与TRIP4低表达组比较差异均有统计学意义（χ2分别为3.983、8.836，P均＜0.05）。

3 讨论

乳腺癌由乳腺上皮细胞增殖失控进而恶变形成，其发生、发展与多种基因异常表达密切相关［7-9］。尽管近年来手术、放化疗、免疫和靶向治疗取得一定进展，乳腺癌患者预后得到一定程度改善，但部分乳腺癌患者在确诊时已存在转移，目前尚无治愈方法，预后较差，因此还需进一步探索其发生、发展机制，以促进乳腺癌治疗策略完善［10-11］。

miRNA是一类小分子RNA，能通过结合靶基因3'-非翻译区导致靶基因转录后沉默，从而调控细胞增殖、分化、迁移、自噬、周期阻滞、糖酵解、凋亡、DNA损伤修复等功能，影响癌症进展［12-13］。如miR-492能靶向抑制细胞因子信号抑制因子2促进乳腺癌增殖、迁移和侵袭［12］。miR-425-5p能靶向抑制第10号染色体上缺失的磷酸酶和紧张素同源物促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭［13］。miR-216a-5p位于染色体2p16.1，是一个与糖尿病发生密切相关的miRNA。PANG等［14］研究报道，miR-216a-5p能通过调控Rap2B抑制小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡。PAN等［15］研究显示，miR-216a-5p能通过下调SRY盒转录因子5抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭、自噬和诱导凋亡。本研究结果显示，与癌旁组织比较，乳腺癌组织中miR-216a-5p表达降低，提示miR-216a-5p可能在乳腺癌发展中发挥作用。癌细胞是一种变异细胞，具备无限增殖能力，能通过促进增殖和抑制凋亡而无限增殖，导致淋巴结或其他部位转移，从而促进癌细胞的发展，导致预后不良。本研究结果还显示，乳腺癌组织中miR-216a-5p表达与HER-2表达、Ki-67增殖指数、TNM分期、淋巴结转移有关，进一步说明miR-216a-5p参与乳腺癌恶性发展，其机制可能与miR-216a-5p能抑制p21蛋白激活激酶2（PAK2）表达有关。PAK2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能被生长因子和胞外信号活化，调节细胞周期、有丝分裂、凋亡和血管生成、基因转录调节等生物学过程，在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。ZHANG等［16］研究报道，上调miR-216a-5p能靶向抑制PAK2表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力。本研究结果显示，miR-216a-5p高表达组3年无进展生存率和总生存率明显升高，说明miR-216a-5p可能成为预测乳腺癌的一个新的生物标志物和一个新的治疗靶点。

ASC-1是负责桥接转录因子或重塑染色质结构的因子，亦是转录因子Ap1、血清反应因子、核因子-κB的共激活因子。早期研究指出，ASC-1的UFMylation是雌激素受体α反式激活的关键步骤，ASC-1过表达能促进雌激素受体α介导乳腺癌形成［17-18］。而TRIP4作为ASC-1的亚基，介导基础转录因子转录和活化，因此，我们推测TRIP4可能参与乳腺癌进展。目前，关于TRIP4与肿瘤关系的研究刚起步，最初HAO等［5］研究发现，黑色素瘤中TRIP4高表达，并通过激活核因子-κB上调环氧合酶-2和诱导型一氧化氮合酶表达，促进黑色素瘤增殖、迁移、侵袭，且抑制TRIP4能提升抗鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1靶向药物的敏感性。基于TRIP4对肿瘤的影响，近期CHE等［19］研究发现，TRIP4在宫颈癌中高表达，能通过激活丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、人端粒酶逆转录酶信号通路，促进宫颈癌生长和转移，并降低宫颈癌放疗敏感性。本研究结果显示，与癌旁组织比较，乳腺癌组织中TRIP4表达升高，提示TRIP4可能在乳腺癌发展中发挥作用。进一步分析显示，乳腺癌组织中TRIP4表达与HER-2表达、Ki-67增殖指数、TNM分期、淋巴结转移有关，说明TRIP4参与乳腺癌恶性发展，可能与TRIP4能激活多种信号通路有关［19］，但关于TRIP4参与乳腺癌的机制还需进一步证实。本研究结果显示，相比TRIP4低表达组，TRIP4高表达组3年无进展生存率和总生存率明显降低，说明TRIP4亦可能成为预测乳腺癌的一个新的生物标志物和一个新的治疗靶点。本研究进一步分析发现，乳腺癌组织中miR-216a-5p与TRIP4表达呈负相关，提示miR-216a-5p与TRIP4可能共同参与了乳腺癌恶性进展，分析与TRIP4为miR-216a-5p的下游调控靶点有关。杨霞等［20］通过双荧光素酶报告基因实验证实，上调miR-216a-5p能靶向抑制TRIP4表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖和促进凋亡。

综上所述，乳腺癌组织中miR-216a-5p低表达，TRIP4高表达，与HER-2表达、Ki-67增殖指数、TNM分期、淋巴结转移和预后有关，可能成为评估乳腺癌预后的标志物。