ctDNA在转移性去势抵抗性前列腺癌mCRPC中的治疗意义及研究进展

康正，张轶庠，袁也晴

(暨南大学第二临床学院，广东 深圳 518000）

0 引言

前列腺癌（PCa）是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，在世界范围内，其发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二位，仅次于肺癌[1]。而在我国，根据2015年全国肿瘤登记地区资料显示，前列腺癌位列男性恶性肿瘤发病率第6位，占男性恶性肿瘤发病构成的3.35%；位列男性恶性肿瘤死亡率第10位，占男性恶性肿瘤死亡构成的2.1%[2]。近几年，我国前列腺癌发病率呈显著上升趋势[3-4]，且在初诊时多数已属中晚期。转移性前列腺癌（metastatic prostate cancer，mPCa）是严重影响前列腺癌患者预后的重要疾病阶段。在欧美人群中，mPCa仅占新发前列腺癌的5%-6%[5-6]，而在我国，这一比例高达54%[7]。持续雄激素剥夺疗法（androgen-deprivation therapy，ADT）是转移性前列腺癌最主要的治疗方式，也是各种新型联合治疗方案的基础，但经过中位时间18-24个月的内分泌治疗后，但几乎所有患者经治疗后都会进展为转移性去势抵抗性前列腺癌（metastaticcastration-resistantprostatecancer，mCRPC）。mCRPC是指前列腺癌患者经过初始ADT治疗后，血清睾酮达到去势水平（＜50ng/dl或＜1.7nmoL/L），但是疾病进展并出现转移的前列腺癌阶段，疾病进展可表现为PSA水平持续升高（PSA进展）或影像学可见的肿瘤进展（影像进展）。尽管去势后的睾酮水平很低，但病情仍在发展，预后极差[8-9]。晚期前列腺癌治疗方法有很多新进展，但转移性前列腺癌患者的5年存活率估计为30%，这种高死亡率很大程度上归因于转移性去势抵抗性前列腺癌[10]。mCRPC发病有多种复杂机制参与，对ADT治疗敏感性、组织病理类型及基因型存在异质性，也就决定无法用单一的方法进行治疗。因此，有必要根据mCRPC形成的分子机制及病理特征进行分型，然后根据各自的特点，采用针对性的个体化治疗[5]。而循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作为一种非侵入式且易于操作的检测方式，可在mCRPC患者治疗过程中进行DNA层面分析，对于探索耐药机制及疾病进展、预后监测等方面发挥越来越重要的作用[11]。

1 ctDNA检测

1.1 ctDNA定义及检测方法

循环游离DNA(cfDNA)是指循环血液中的核酸类物质，包括循环血液中细胞内的核酸、游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA和RNA等，细胞凋亡和坏死过程是cfDNA主要来源。cfDNA的增加并不是恶性肿瘤所特有的，其他生理和病理过程也导致cfDNA水平升高，如怀孕、运动、炎症、糖尿病、脓毒症和心肌梗死等。cfDNA的血浆水平在正常人个体之间差异很大，但通常低于10ng／mL，在肿瘤患者血浆中cfDNA的浓度通常较高，其中mCRPC患者平均为19 ng/mL[12]。在肿瘤患者的血浆中，cfDNA的主要成分是肿瘤细胞释放的循环肿瘤DNA(ctDNA)，其中影响ctDNA浓度的因素较多，包括肿瘤转移体积，转移部位和肿瘤进展，以及不同肿瘤位置和肿瘤微环境等。此外，ctDNA的半衰期相对较短，从几分钟到几个小时不等[13]，短半衰期使ctDNA优于临床上通常用于监测肿瘤进展的基于蛋白质的生物标志物，例如血清前列腺特异性抗原(PSA)。其在临床中常用于前列腺癌疗效监测，但是其具有更长的半衰期，并且需要数周才能经历代表肿瘤动力学的变化[8]。另外，据Shaya Justin[14]等研究，在ctDNA检测时，检测到的病原性改变的数量与较低的总体存活率密切相关，而改变的数量与前列腺特异性抗原（PSA）的相关性较弱。这些数据表明，ctDNA在预测mCRPC的预后方面独立于PSA，也可以作为一种新的判断mCRPC预后和疗效的生物标志物。值得一提的是，穿刺组织标本是前列腺癌相关生物标志物检测的金标准，但是由于其存在穿刺活检阳性率、穿刺样本异质性及穿刺相关并发症等问题，限制了穿刺组织在mCRPC中的检测应用。而液体活检是以循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）、ctDNA和外泌体为研究对象，通过无创性抽样方法获取肿瘤细胞信息的检查技术 ，通过液体活检技术对ctDNA检测可明确肿瘤在发展过程中基因突变、拷贝数变异、染色体重排和甲基化等基因改变[47]。与组织穿刺相比较， 液体活检样本的提取方便快捷、风险小、储存运输成本低，患者接受度高，此外ctDNA分析能够客观地反映所有癌症转移中的突变，甚至比标准组织活检检查到更多的突变基因，对于癌症的早期诊断和癌症治疗过程中的疗效评估具有重要意义。由于ctDNA的质量和数量变化大，因此需要高特异性和高度灵敏的检测方法，目前常用的方法包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、磁珠乳液扩增BEAMing(bead,emulsion,amp lification and magnetic)、高通量测序（ next generation sequencing, NGS )、 ARMS、液滴数字PCR ( ddPCR)等。

1.2 液体活检与组织活检一致性比较

在mCRPC患者中，骨骼通常是转移扩散的唯一部位，从前列腺癌的骨骼中获取肿瘤组织的成功率从25%到75%不等，类似于ctDNA分数与总体肿瘤负荷指标呈正相关[15-19]。据lexander W. Wyatt等[8]多项研究，在mCRPC驱动基因AR、BRCA2、ATM、PTEN、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、TP53中，观察到可评估液体和固体活检之间单个基因拷贝数调用的一致性为88.9%；ctDNA与固体组织活检在基因组重排也有较好的一致性，虽然大多数重排都落在内含子内，并且不能通过外显子集中测序方法检测到，约47.4%在配对的实体活检中显示了基因重排的证据。此外，2018年不列颠-哥伦比亚大学的Martin Gleave教授等在《J Natl Cancer Inst》发表了相关的研究，从体细胞突变/拷贝数变异/结构变异三个方面，比较了两者的一致性：在体细胞突变及拷贝数方面，两者具有很好的一致性；在体细胞结构变异方面，两者的一致性较为一般。ctDNA和转移组织活检在mCRPC中的显着一致性表明ctDNA测定可以较好的用于对患者进行分子分层以用于预后和预测目的。值得一提，前列腺癌患者行组织穿刺活检过程中，由于活检条件受限如肿瘤转移部位活检难度高、转移灶小以及患者依从性等情况，穿刺结果也存在较大的误差。而据Shaya Justin等[8]研究，在相应的实体活组织检查中未检测到液体活组织检查中检测到的109个体细胞突变中的36个（33.0%），其中29例是由于实体活检覆盖率不足，但7例突变在实体活检中显示统计学缺乏证据（P＜0.01，Fisher精确检验）。相比较而言，液体活检有可能捕获单个转移部位的组织活检可能遗漏或低估的肿瘤基因突变异质性。

2 ctDNA在mCRPC患者中的应用

2.1 ctDNA在mCRPC患者中检测现状

对于中枢神经系统肿瘤患者，脑脊液中的基因分子谱可能比血流中的更准确[20]。同样，对于mCRPC患者，除了血清和血浆之外的其他生物体液也被研究者认为前列腺癌诊断和治疗生物标志物的潜在来源，如尿液和精液[21-22]。由于直接接触前列腺组织和原发性肿瘤，对尿液及精液进行cfDNA和ctDNA分析的优点是可以从直接接触肿瘤源头的体液中收集靶向信息[23]。据相关研究表明，与其他恶性肿瘤患者相比，前列腺癌患者血液中的ctDNA水平明显高于健康人[24-27]。此外，在一项对患有良性前列腺增生(BPH)的前列腺癌患者的研究中，ctDNA水平据报道明显高于对照组[28]。2015年，癌症基因组图谱研究网络报告了333例原发性前列腺癌的研究结果，结果发现19%的原发性肿瘤存在DNA修复基因突变，包括3%的同源重组修复(HRR)基因BRCA2[29]。150例转移活检的外显子组测序发现，23%的转移性前列腺癌携带DNA修复关键基因的改变，同样涉及同源重组修复基因(BRCA2、ATM和BRCA1)以及错配修复基因(MLH1和MSH2)[30]。这些基因的改变包括碱基对替换、缺失、插入、拷贝数变异(CNV)和选择性重排[31]。而据Sonpavde等研究，mCRPC患者ctDNA含量及可检测性高，大多数（94%）出现了一次以上的ctDNA改变（alterations），最常见的复发性体细胞突变是发生于TP53（36%的患者）；AR（22%）；APC（10%）；NF1（9%）；EGFR（6%）；CTNNB1（6%）；ARID1A(6%)；BRCA1（5%），BRCA2（5%），PIK3CA（5%）。最常见的拷贝数增加的基因是AR（30%），MYC（20%）和BRAF（18%）基因。此外，大量的ctDNA改变与较短的治疗失败时间（TTF）相关（HR：1.05；P=0.026）；AR改变趋向于较短的治疗失败时间（TTF）（HR,1.42；P=0.053)和较短的无进展生存期(PFS)（HR,2.51；P=0.09）[32]。

2.2 ctDNA在mCRPC患者中的耐药机制研究

雄激素受体（AR）属于核受体超家族中的类固醇受体，作为细胞内转录因子，在前列腺细胞中高表达[33]。它的主要配体是睾酮和5-二氢睾酮，它们的结合决定了胞浆内受体的激活，包括同质二聚化、自磷酸化和移位到细胞核[34]。AR通过确保细胞存活、增殖、迁移和侵袭，在mCRPC的发展中起着重要作用[35]。据Matti Annala等[36]研究，约53%的前列腺癌患者在治疗后体细胞群体基因发生了变化，特别是在治疗反应强烈之后。与治疗相关的变化集中在AR基因上，AR拷贝数平均增加50%，AR突变频率发生变化，携带AR配体结合域缩短重排的患者比例增加2.5倍。研究结论显示在mCRPC患者AR抑制和驱动获得性耐药的序列过程中，显性AR基因型继续进化。而Sidaway P等[37]研究显示，在mCRPC患者中，在活检样本中检测到AR突变的比例相似（10%-20%），在ctDNA中有AR拷贝数增加和扩增、多个AR突变、RB1丢失、MET增加和MYC增加的患者比没有这些基因组特征的患者对苯扎鲁胺耐药的风险更高[38]。 某项前瞻性研究提到，抗雄激素治疗期间出现的一些AR突变与比卡鲁胺或阿比特龙-泼尼松治疗耐药相关，并且已知对其他治疗敏感，这些畸变的识别有助于指导治疗；此外， 血液活检中发现雄激素受体剪接变异体（androgen receptor-va-riant，AR-V7）检查阳性的患者对阿比特龙及恩扎鲁胺的治疗效果不佳，但是不影响多西他赛的疗效[39]；Quigley等[40-41]研究对两名含有BRCA2突变的患者进行了ctDNA完整外显子靶向测序，显示产生BRCA2基因逆转突变的前列腺癌患者对聚腺苷二磷酸荷塘聚合酶（PARP）抑制剂产生耐药性。

2.3 ctDNA指导mCRPC个性化药物治疗

在ASCO 2021上提出的逐个基因的探索性分析显示，对于BRCA基因突变的患者，奥拉帕利布和苯扎鲁胺或阿比特龙的客观缓解率（ORR）分别为43.9%和0%，中位总生存期（OS）分别为20.1和14.4个月。关于其他被分析的基因，单一奥拉帕利治疗也导致CDK12改变的患者的ORR更高(5.9%比0%)，但ATM改变的患者ORR不高(10.0%比10.0%)，在ATM或CDK12改变的患者中无进展生存期（PFS）或总生存期（OS）差异无统计学意义[42]，而在其他DDR基因如PALB2、FANCA、BRIP1和RAD51B中已证实有反应[43]。据Hussain M等[44]研究，其中发现奥拉帕利布可显著改善BRCA 1/2或ATM mCRPC患者的放射学无进展生存率，在16%的mCRPC队列中检测到BRCA 1/2或ATM扰动，使用ctDNA分析可以免除这些患者接受潜在的痛苦的肿瘤活检程序或接受雄激素受体途径抑制剂治疗的需要。基于上述研究结果，导致FDA在2020年批准了两种PARP抑制剂，奥拉帕利和鲁卡帕里布，用于DNA修复基因改变的mCRPC。此外，GOODdall等[45]在mCRPC患者奥拉帕尼Ⅱ期的临床试验中显示，经过8周的奥拉帕利治疗后患者的ctDNA浓度中位数下降了49.6%，同时ctDNA水平的下降伴随着无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的改善，同时治疗后血液中ctDNA含量的变化和复发有关。此外，mCRPC患者细胞中PD-L1表达增多，并且前列腺肿瘤微环境中的CD8+T细胞高表达PD-1[46-47]，PD-1/PD-L1抑制剂已经证实对于mCRPC患者具有疗效，尤其是MCRPC患者基因检测中存在微卫星不稳定（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）的患者具有较高的临床价值[5]，因此PD-1/PD-L1抑制剂为晚期前列腺癌的免疫治疗提供了新手段。另外，HRR基因突变与对PARP抑制剂和铂疗法的敏感性增加有关，血浆中HRR基因突变的检测与转移活检组织分子分析中这些突变的检测高度相关。因此，能够识别由于快速出现适应性耐药而导致早期治疗失败的患者，从而及时更换治疗药物。

2.4 ctDNA对mCRPC患者疗效及预后风险评估

国内外针对mCRPC的个体化精准治疗仍处临床研究阶段，其重点是探索mCRPC治疗方式、准确的评估患者预后及进行疾病进展风险分层[8]。转移性去势耐受前列腺癌(mCRPC)的基因组图谱不同于原发癌，在肿瘤进展过程中是动态的，对ctDNA动态分析使我们能够更好地了解肿瘤进展的机制。值得注意的是，在转移性去势敏感性前列腺癌（metastatic hormone sensitive prostate cancer，mHSPC）状态下，即使患者经历了血清PSA水平下降的生化反应，TP53和ATM中也出现了早期的基因组变化。这些早期的基因组变化强调了前列腺癌在睾酮抑制下的基因组可塑性，这些变化也可能在mCRPC中的抑癌基因和DDR基因中发挥关键的生物学作用，并可用于监测微小残留病灶。此外，Alok Mishra[48]等通过与常规测量方法的直接比较，论证了人ctDNA在无创性、非终末期测量人PCa转移瘤负荷中的应用。结果表明，ctDNA准确地反映了前列腺肿瘤在软组织和骨骼中对IR的生长和治疗反应，支持了在ctDNA在mCRPC转移瘤模型中明确人类特异性基因序列的日益增长的价值和方便性。

3 ctDNA临床应用限制

ctDNA在mCRCP有着独特的临床价值,但是由于其存在一定技术局限性，在临床实践中应用不广泛。ctDNA相关检测主要存在以下问题：①我国前列腺癌患者中晚期患者所占比例较高，ctDNA水平很高，ctDNA检测可用于治疗积极病情监测；而对于早期病变和微小残留病变，由于肿瘤负荷小，不能敏感检测到微量的DNA变异，尽管测序技术的灵敏度虽然随着技术的发展而提高，但仍受到足够量ctDNA可用性的限制[16]。下一代测序(NGS)和数字PCR等高灵敏度和高特异性的技术的出现极大地促进了ctDNA领域的发展，并使检测低ctDNA组分的基因组改变成为可能；②目前而言，ctDNA检测仅在少数医院开展，具有成本高、价格昂贵等缺点，且随着肿瘤疾病的进展需要进行多次采样分析，对于患者经济承受力要求较高；③ctDNA分析的特异性受到DNA质量和测序技术的限制，由于并不是所有的突变或拷贝数变异都具有生物学意义，因此对血浆DNA中基因组畸变的鉴定需要谨慎的解释，需要一种全面的生物学和临床方法来验证新的生物标志物。且由于采用、分析过程中缺乏统一的国际标准及成熟质量评价体系，检测结果的可靠性受到质疑[16]；④血浆DNA的分析不能捕捉到额外的生物复杂性层面，如RNA表达或可能与临床相关的蛋白质水平的差异[49]。

4 总结与展望

ctDNA检测具有方便快捷、可重复取样、消除肿瘤异质性特点，作为一种新型肿瘤基因检测的工具，对于mCRPC患者的筛查、指导治疗及实时监测具有重要意义。ctDNA检测可以作为组织活检的补充方案，其非侵入性等特点使体液活检比传统穿刺组织活检手段更具优势，甚至一定程度上可以作为肿瘤组织活检替代方案。现阶段，联合使用ctDNA和原发肿瘤组织是评估分子亚型的理想方法，并为在精确肿瘤学背景下实施靶向治疗铺平道路[13]。虽然目前阶段存在检测难、费用高、标准不统一等问题，但是随着NGS等技术的快速发展，测序成本的降低，前列腺癌已经进入精准/个体化治疗时代，前列腺癌精准诊治政策已让越来越多的患者收益。