淀粉酶纳米花型时间-温度指示剂的制备及性能分析

胡晓波，王 麟，李小娟

（河南牧业经济学院，河南 郑州 450046）

民以食为天，食以安为先，食品安全是关乎人民健康的重大基本民生问题。在食品的整个流通过程中，除了自身影响因素外，食品的质量和安全与外部环境因素（如时间、温度、湿度、光照和机械应力等）密切相关[1]，其中温度又是导致食物腐败最不可预测的因素，有效监测食品流通过程中的温度变化至关重要[2]。时间-温度指示剂（time-temperature indicator，TTI）作为一种具有显示作用的智能标签，能通过化学反应或者物理变化在时间和温度上的累积效应[3]，监控和记录食品从生产、运输到销售各环节的温度历史，动态显示食品的剩余保质期，为食品生产者、物流管理者以及消费者提供准确检测和评估食品品质的方法[4-7]。

根据反应原理和指示方法的不同，TTI通常分为扩散型、聚合物型和酶型等[8-9]。其中，酶型TTI基于酶与底物之间的反应进行，通过改变酶的类型、起始pH值等就可以改变酶型TTI体系和活化能以适应不同的产品，易于控制且性能稳定、成本低廉，具有更高的准确性和适用性[10-12]。根据TTI中酶的存在形态不同，可将其分为液态酶型TTI和固态酶型TTI，液态酶型TTI中酶不稳定，易失活，限制了其商业化应用[13]。因此，基于固定化酶技术对酶进行固定化，再利用酶促反应构建而成的固态酶型TTI成为一个新的研究方向[3,10,14]。

本研究首先利用淀粉酶中氨基酸残基与铜离子之间的相互作用，对淀粉酶进行固定化，制备淀粉酶@Cu无机杂化纳米花[14-16]，研究淀粉酶质量浓度对纳米花形貌结构的影响，筛选出花形最好纳米花[17]，并测试纳米花中淀粉酶的生物活性及保存稳定性。然后以可溶性淀粉为底物，碘液为指示剂，改变淀粉酶@Cu纳米花的用量，制备出6种配方的淀粉酶纳米花型TTI[18-22]，观察其在不同温度下的颜色变化过程，确定吸光度随时间变化的动力学参数，计算出TTI的活化能。根据TTI与食品匹配原则，确定该系列TTI活化能指示范围，以期为实时监控食品的质量变化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

可溶性淀粉、淀粉酶 上海市阿拉丁生物技术有限公司；氯化钠、氯化钾、硫酸铜、盐酸、碘、碘化钾天津市永大化学试剂有限公司；十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA224S-CW电子天平 德国Sartorius公司；TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司；Scientz-10N冷冻干燥机 宁波新芝科技股份有限公司；TU-1950紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Quanta 250 FEG场发射扫描电镜 美国FEI公司；D8 Advance X射线衍射仪 德国Bruker公司；Nicolet iS20傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司；STA 2500同步热分析仪 德国Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉酶@Cu杂化纳米花的制备

称取10.64 g Na2HPO4·12 H2O、1.39 g KH2PO4、0.40 g氯化钾、16.01 g氯化钠，加水配制成2 L pH 7.4的磷酸缓冲溶液。将6.67 mL 120 mmol/L的硫酸铜溶液和500 mL淀粉酶缓冲溶液混合均匀，其中淀粉酶质量浓度分别为0.025、0.05、0.075、0.1、0.2 mg/mL和0.5 mg/mL。25 ℃水浴中静置3 d后进行离心，沉淀用高纯水进行洗涤，冷冻干燥得到淀粉酶@Cu无机杂化纳米花材料，分别标记为NF-1、NF-2、NF-3、NF-4、NF-5和NF-6。

1.3.2 淀粉酶@Cu杂化纳米花中淀粉酶含量计算

为了测定纳米花中淀粉酶的含量，对干燥的淀粉酶@Cu杂化纳米花进行煅烧，使用STA-2500同步热分析仪测定其热失重曲线，其中纳米花中淀粉酶的质量损失温度为100～800 ℃。淀粉酶在纳米花中的质量分数按式（1）计算：

式中：W为淀粉酶质量分数/%；G0为淀粉酶质量；GN为纳米花质量。

1.3.3 淀粉酶@Cu杂化纳米花活性测试

可溶性淀粉标准曲线的绘制方法：准确配制质量浓度为1.0～3.0 mg/mL的淀粉标准系列，分别将1.0 mL上述淀粉标准液与2.0 mL 1 g/L碘液混合，测试溶液在580 nm波长处的吸光度，以淀粉质量浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，拟合出标准线性回归方程。向1.2 mL 2 mg/mL可溶性淀粉溶液中加入干燥的淀粉酶@Cu纳米花，保证纳米花中淀粉酶的质量为1 mg，溶液在50 ℃反应30 min，加入0.3 mL 1 mol/L HCl溶液终止反应，再加入1.5 mL 1 g/L碘液，测定上清液在580 nm波长处吸光度。作为对比，用1 mg淀粉酶代替纳米花，用同样方法测定天然淀粉酶活性。在该实验条件下，每分钟降解1 mg淀粉所消耗的酶量定义为一个酶活力单位（U），每毫克淀粉酶中所含有的酶活力单位数定义为比活力（U/mg），由式（2）计算：

式中：S为酶的比活力/（U/mg）；m0为初始淀粉质量（2.4 mg）；mt为反应终止后溶液中剩余的淀粉质量（由淀粉标准曲线计算）；me为纳米花中淀粉酶含量（1 mg）；t为反应时间（30 min）。

1.3.4 淀粉酶@Cu杂化纳米花稳定性测试

将天然淀粉酶和淀粉酶@Cu纳米花分别溶于pH 7.4磷酸缓冲溶液中，溶液室温下长时间放置，利用紫外-可见分光光度计测定淀粉酶和淀粉酶@Cu纳米花生物活性随放置时间的变化情况。

1.3.5 淀粉酶纳米花型TTI的制备

1.3.5.1 可溶性淀粉溶液质量浓度的确定

分别配制质量浓度为10、20、30、40 g/L和50 g/L的可溶性淀粉溶液，各取15 mL与4.5 mL碘液（1 g/L）、40 mg淀粉酶@Cu纳米花混合，测体系在580 nm波长处的初始吸光度，在4 ℃下保存，每隔24 h测反应体系的吸光度。

1.3.5.2 碘液质量浓度的确定

分别配制质量浓度为0.5、0.75、1、1.25 g/L和1.5 g/L的碘液，各取4.5 mL与15 mL可溶性淀粉溶液（40 g/L）、40 mg淀粉酶@Cu纳米花混合，测体系在580 nm波长处的初始吸光度后4 ℃保存，每隔24 h测反应体系的吸光度。

1.3.5.3 TTI的制备

确定出淀粉溶液和碘液的最佳质量浓度后，将15 mL可溶性淀粉溶液和4.5 mL碘液混合均匀，分别加入10、20、30、40、50、60 mg的淀粉酶@Cu纳米花，制备出6种配方的TTI，分别标号为1#TTI、2#TTI、2#TTI、3#TTI、4#TTI、5#TTI和6#TTI。

1.3.6 TTI体系颜色变化及动力学参数的确定

将6种配方的TTI溶液分别放置在5、15、25、35 ℃的恒温培养箱中反应，每隔一段时间进行拍照，并测试溶液在580 nm波长处吸光度，绘制吸光度随时间变化的曲线。利用Origin软件对TTI的吸光度-时间曲线进行拟合，得到TTI在不同温度下的反应速率常数。根据Arrhenius方程[23]，求得TTI反应体系的活化能，从而确定出淀粉酶纳米花型TTI的适用范围。

2 结果与分析

2.1 淀粉酶@Cu纳米花的制备

蛋白质-无机杂化纳米花是一种新型固定化酶材料，实验中利用淀粉酶和硫酸铜制备了淀粉酶-无机杂化纳米花NF-1、NF-2、NF-3、NF-4、NF-5和NF-6，用扫描电镜对其形貌进行表征。从图1可知，在制备纳米花过程中，溶液中淀粉酶质量浓度较低时，得到的纳米花NF-1、NF-2和NF-3花状结构不完整，存在大量碎片，这是因为淀粉酶质量浓度较低时，溶液中晶体成核位点较少，影响晶体生长；纳米花NF-4和NF-5出现完整的花状结构，但形貌不统一，仍有碎片存在；淀粉酶质量浓度增大到0.5 mg/mL时，溶液中存在大量成核位点，纳米花NF-6中没有碎片存在，只有完整的花状结构。以上结果说明在形成纳米花过程中，淀粉酶质量浓度直接影响纳米花的形貌结构，实验选用NF-6进行下步研究。

图1 淀粉酶与硫酸铜反应产物扫描电镜图（×5 000）Fig. 1 SEM of the reaction product between amylase and copper sulfate (× 5 000)

通过X射线衍射对纳米花NF-6的晶体结构进行表征，如图2a所示。NF-6分别在9.09°、12.89°、20.92°、29.45°、33.64°、37.21°、41.86°和53.52°处出现强的特征衍射峰，与Cu3(PO4)2·3H2O的标准卡片（JPSCD 00-022-0548，图2b）一致，说明纳米花NF-6具有高结晶度，且其结构中的无机组分是Cu3(PO4)2·3H2O。

图2 纳米花NF-6（a）和Cu3(PO4)2·3H2O（b）的X射线衍射图Fig. 2 XRD pattern of NF-6 and Cu3(PO4)2·3H2O

利用红外光谱仪测定纳米花NF-6的红外吸收光谱，如图3所示。NF-6在600～500 cm-1和1 100～940 cm-1出现强吸收峰，这是P—O振动和O—P＝O弯曲造成，证明纳米花中含有磷酸基团；在1 600～1 400 cm-1出现酰胺键的特征吸收峰，在3 000～2 800 cm-1出现—CH2—和—CH3伸缩振动吸收峰，在3 500 cm-1处出现O—H强的宽吸收峰，说明纳米花中含有淀粉酶。

图3 NF-6的红外吸收光谱图Fig. 3 Infrared absorption spectrum of NF-6

2.2 淀粉酶@Cu纳米花活性分析

通过热重分析研究淀粉酶@Cu杂化纳米花中淀粉酶含量，如图4所示。从纳米花的热失重曲线可知，从室温到100 ℃质量损失6.06%，100～800 ℃范围内质量损失19.58%，即纳米花中结晶水质量分数为6.06%，淀粉酶质量分数为19.58%，而Cu3(PO4)2仍作为无机组分存在于纳米花中。

图4 纳米花NF-6的热重分析谱图Fig. 4 TGA spectrum of NF-6

将干燥的天然淀粉酶和淀粉酶@Cu纳米花NF-6分别加入到可溶性淀粉溶液中，反应结束后添加碘液并进行紫外-可见分光光度计测试。利用可溶性淀粉的标准曲线y＝1.009 2x+0.012 6（R2＝0.997 6），计算出天然淀粉酶比活力为18.24 U/mg，NF-6中淀粉酶比活力为62.36 U/mg。将天然淀粉酶的活性定义为100%，可计算出NF-6的相对活性为342%，说明淀粉酶固定化后其活性提高到3.42 倍，这主要是因为纳米花比表面积大，能增大酶与底物之间的传质，提高酶的生物活性。

实验配制相同淀粉酶质量浓度的天然淀粉酶和淀粉酶@Cu纳米花NF-6溶液，将溶液放置室温下，以起始天然淀粉酶活性作为参照，测定淀粉酶及纳米花中淀粉酶在不同时间下的相对活性。从图5可知，随着放置时间的延长，天然淀粉酶和纳米花中淀粉酶相对活性逐渐减低，但纳米花中淀粉酶相对活性降低速度较慢。7 d后，天然淀粉酶的相对活性为21.5%，而纳米花中淀粉酶相对活性为187%，明显高于天然淀粉酶活性。这是因为纳米花结构能够保护淀粉酶，使其保存稳定性提高，失活速度减慢。

图5 天然淀粉酶和NF-6中淀粉酶不同时间下的相对活性Fig. 5 Relative activities of native amylase and NF-6 after different storage times

以上结果说明淀粉酶能与硫酸铜之间相互作用，形成淀粉酶@Cu纳米花材料，该材料能显著提高淀粉酶的生物活性及保存稳定性，使其更稳定，降低淀粉酶的使用成本。

2.3 淀粉酶纳米花型TTI底物质量浓度的确定

淀粉酶纳米花型TTI是基于淀粉酶与底物之间的酶促反应进行，研究底物质量浓度对TTI指示效果的影响。固定TTI中淀粉酶@Cu纳米花NF-6加入量40 mg、可溶性淀粉溶液加入量15 mL、碘液加入量4.5 mL，分别改变可溶性淀粉溶液和碘液质量浓度，讨论4 ℃条件下其质量浓度对TTI体系在580 nm波长处吸光度的影响。从图6a可知，淀粉质量浓度越大，起始吸光度就越大，但5个质量浓度下吸光度的降低速度基本一致，先快后慢慢趋于平稳。这是由于酶反应的速率与底物质量浓度有关，底物质量浓度越大，反应速率就越快。随着淀粉酶不断水解淀粉，溶液最终趋于无色透明，吸光度趋近于0。其中淀粉质量浓度为40 g/L时，其初始吸光度与50 g/L相差不大，但明显大于其他质量浓度，为后续的吸光度降低提供了空间，即整个过程中吸光度的变化幅度会比较大。从图6b可知，随着碘质量浓度的增加，起始吸光度明显增加，反应时间变长。当碘液质量浓度为0.5、0.75 g/L和1.0 g/L时，TTI体系吸光度降低到0时所需时间分别约为72、96 h和120 h；当碘液质量浓度达到1.25 g/L和1.5 g/L时，5 d后TTI体系仍有颜色，吸光度较高，不利于观察TTI颜色变化。时间已达到所需的6 d。综合考虑，将该TTI中的淀粉质量浓度确定为40 g/L，碘液质量浓度确定为1.0 g/L。

图6 可溶性淀粉质量浓度（a）和碘液质量浓度（b）对TTI体系在580 nm波长处吸光度的影响Fig. 6 Effect of concentration of soluble starch (a) and concentration of iodine (b) on A580 nm of the TTI system

2.4 淀粉酶纳米花型TTI颜色变化过程

在淀粉酶作用下，淀粉发生水解反应，聚合度或相对分子质量逐渐降低，导致其与碘作用形成的包合物发生褪色，由蓝色变成无色，且褪色速度与温度和时间有关[24]。实验观察5、15、25 ℃和35 ℃条件下淀粉酶纳米花型TTI的颜色随时间的变化过程。从图7可知，6种配方的TTI在放置过程中溶液颜色产生从深蓝色-蓝色-浅蓝色-无色的明显变化，且温度越高，变色速度越快。TTI的颜色与食品质量正相关[25]，当TTI呈现深蓝色时，此时食品比较新鲜，可以放心食用；当TTI褪色成无色时，此时食品已发生腐败变质，不能再食用。

图7 不同温度下各TTI颜色随时间的变化过程Fig. 7 Color change of TTIs at different temperatures

2.5 淀粉酶纳米花型TTI动力学参数确定

反应过程中淀粉酶纳米花型TTI在580 nm波长处吸光度发生变化，实验中监测了6种配方的TTI在5、15、25 ℃和35 ℃条件下吸光度随时间的变化，并绘制出吸光度随时间变化的曲线，如图8所示。利用Origin软件采用式（3）对吸光度-时间曲线进行指数函数拟合。

式中：X为TTI体系的吸光度；t为反应时间/h；a、k及b为拟合函数参数。

由此得到淀粉酶纳米花型TTI在不同温度条件下的反应速率k，如表1所示。

图8 不同温度下各TTI吸光度随时间的变化曲线Fig. 8 Absorbance versus time curves of TTIs at different temperatures

表1 各TTI拟合曲线参数及相应lnk值Table 1 Fitting parameters and lnk values for TTIs

从表1可以看出，不同温度条件下的拟合曲线方程相关系数R2都在0.96以上，说明6种TTI在不同温度条件下吸光度与时间的指数相关性显著。

2.6 淀粉酶纳米花型TTI活化能计算

酶促反应中反应温度对反应速率的影响遵循Arrhenius方程[23]：

式中：k为反应速率常数/h-1；k0为指前因子/h-1，对于指定反应是一个常数；Ea为活化能/（kJ/mol）；T为热力学温度/K；R为摩尔气体常数（8.314 J/（mol·K））。

以lnk对1/T作图，若两者呈明显线性关系，则说明不同温度下的反应速率符合Arrhenius方程，可利用Arrhenius方程计算出反应的活化能。根据表1中不同温度条件下相应的lnk值，绘制lnk与1/T的关系曲线，如图9所示。利用Origin软件对各曲线进行线性拟合，得到拟合方程，根据Arrhenius方程可以求得各自的活化能Ea和指前因子k0，如表2所示。

图9 各TTI的lnk与1/T的拟合直线Fig. 9 Fitting curves of lnk against 1/T for TTIs

表2 各TTI的动力参数Table 2 Kinetic parameters for TTIs

由拟合参数可以看出，lnk和1/T的相关性R2在0.93以上，线性关系比较显著，6种配方的TTI活化能分别为14.84、21.00、28.85、33.03、32.55 kJ/mol和32.83 kJ/mol。根据TTI与食品匹配原则，当TTI活化能与食品腐败活化能相差25 kJ/mol时，该TTI便可应用于该产品[26-27]。因此6种配方的TTI可以指示的产品活化能范围分别为0～39、0～46、3～53、8～58、7～57 kJ/mol和7～57 kJ/mol，适用于监测由扩散控制、酶反应、脂肪氧化等原因[28-31]引起腐败变质的食品质量变化。

3 结 论

基于酶与金属离子间的相互作用，成功制备了淀粉酶@Cu纳米花，其中淀粉酶质量浓度为0.5 mg/L，纳米花的形貌结构最完整，该纳米花能显著提高淀粉酶的生物活性和保存稳定性。选用可溶性淀粉溶液为底物，碘液为指示剂，加入淀粉酶@Cu纳米花，制备出6种配方的淀粉酶纳米花型TTI，观察了TTI由深蓝色到无色的变化过程，研究了不同温度下TTI的吸光度随时间的变化曲线。通过动力学参数研究，计算出6种TTI的活化能分别是14.84、21.00、28.85、33.03、32.55 kJ/mol和32.83 kJ/mol，适用于监测由扩散控制、酶反应、脂肪氧化等原因引起腐败变质的食品质量变化。