不同NaCl添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中生物胺产生的影响

宋国顺，张 炎，袁润泽，邱 婷，宋雪梅，梁 琪

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州 730070）

研究发现，过高食盐摄入会对人体产生不良影响，例如：影响胃肠道正常功能，增加胃炎、胃溃疡甚至癌变的发生几率[1-3]。富含钠的饮食也可能与肾脏疾病有关[4]。全民食盐摄入量的减少将有助于改善公共健康。因此，低盐食品的需求量将不断增多。

除了Domiati干酪之外，所有类型干酪都存在盐的添加。根据干酪种类不同，干酪中盐含量差异较大。软质、半硬质和硬质干酪中盐含量为0.5%～2.5%，蓝纹型干酪中盐含量为3%～5%[5]。盐对干酪组成、风味、微生物生长、酶活性、凝块收缩等多方面具有重要影响[6-8]。盐添加量的改变势必影响干酪pH值、水分活度、微生物自溶以及蛋白质降解等[9]。一般而言，较高盐浓度能够降低食品中水分活度，抑制微生物包括产胺微生物的生长繁殖。然而，盐含量减少后，微生物菌群发生变化，发酵剂生长周期延长，非发酵剂的种类和数量将改变，导致蛋白质降解动态变化，从而影响干酪中代谢产物如生物胺的变化。

生物胺是一类具有生物活性的有机、碱性、含氮化合物，干酪中生物胺的合成需具有脱羧酶的微生物、适宜的环境条件以及相应的氨基酸底物[10]。已在一些成熟期较长的干酪，如切达干酪、豪达干酪、瑞士干酪中发现生物胺[11-13]。少量生物胺有利于人体生理调控，但过量生物胺的摄入会对人体健康产生严重影响[14]。马德胜[15]研究发现盐添加量为3%的干酪中生物胺的含量低于盐添加量为2%和1%的干酪。Santos等[16]研究发现向乳球菌发酵的脱脂复原乳中添加5% NaCl能够降低生物胺的形成。De A Møller等[17]研究发现，与盐水比为5.4%～6.3%的干酪相比，盐水比为3.5%～3.7%的干酪中组胺含量更高。Manca等[18]发现未杀菌绵阳乳干酪中生物胺与盐含量间无相关性。由于原料乳、产胺微生物特性、产品工艺、实验条件等差异，细胞脱羧酶系统对环境因素的反应出现较大变化，导致盐含量对生物胺形成的影响也呈现差异。

牦牛乳具有较强季节性，牦牛乳硬质干酪的制作能有效充分利用牦牛乳，提高其附加值，助力当地牧区经济发展[19]。然而牦牛乳硬质干酪生产环节中盐的添加不可或缺，因此，随着食品工业对低盐食品的关注，着力发展低盐牦牛乳硬质干酪，对于带动牦牛乳产业升级具有重要战略意义。前期研究发现牦牛乳硬质干酪中存在生物胺，但是盐添加量的减少对牦牛乳硬质干酪质量安全性的影响却鲜有报道。生物胺的形成具有菌株特异性，不同微生物的产胺能力具有较大差异，不同学者已从干酪中分离出不同产胺微生物如Pseudomonasspp.、Enterococcus faecalis、Enterococcus durans和Debaryomyces hansei等[20]。干酪中微生物区系与原料乳来源、制作工艺等密切相关[21]。

本研究以盐添加量的改变为切入点，探究不同盐添加量牦牛乳硬质干酪成熟过程中生物胺的变化规律，且从不同盐含量的干酪中筛选产生物胺的菌株，为开发牦牛乳低盐干酪和调控牦牛乳硬质干酪中生物胺的形成提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛乳采自甘南藏族自治区卓尼县木耳乡大峪沟（海拔2 300 m）。

凝乳酶、发酵剂（由IDC 604嗜热发酵剂与DOM 1嗜温发酵剂等质量1∶1混合组成） 北京多爱特生物科技有限公司；生物胺标准品、丹磺酰氯、L-脯氨酸、1,7-二氨基庚烷 美国Sigma公司；色氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、溴甲酚紫 上海麦克林生化科技有限公司；乙腈（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醚（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；碳酸氢钠（分析纯） 天津市百世化工有限公司。

M17肉汤培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；pH 5.5的产胺微生物初筛培养基[22]：含0.5%酵母膏、0.5%牛肉膏、0.5%胰化蛋白胨、0.25% NaCl、0.05%葡萄糖、0.1%吐温80、0.02% MgSO47H2O、0.005% MnSO4·4H2O、0.04%硫酸铁、0.2%柠檬酸三铵、0.01%碳酸钙、0.005% VB6、0.2%磷酸氢二钾、0.006%溴甲酚紫、2%琼脂，在121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

TGL-20M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；723型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；WD-12氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；BX53全复型+DPP4荧光显微镜 日本奥林巴斯公司；干酪槽为实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 牦牛乳硬质干酪的制作和取样

参考刘兴龙等[23]方法制备干酪：牦牛乳→63 ℃巴氏杀菌30 min→冷却至35 ℃→添加0.006 25 g/L发酵剂→添加0.3 g/L CaCl2→添加0.667 g/L凝乳酶→凝乳1 h→切割成1 cm3小块→排乳清→搅拌加盐（凝块质量的1.0%、1.3%、1.8%和2.3%）→45 ℃二次加热15 min→堆酿2 h→压榨成型→真空包装→成熟。

将制作好的4种不同盐分的新鲜牦牛乳硬质干酪，真空包装后置于4 ℃冰箱，分别成熟0、1、2、3、4、5、6个月。将不同成熟期的干酪于-80 ℃贮藏备用。

1.3.2 干酪中NaCl含量的测定

根据GB 5009.44—2016《食品中氯化物的测定》[24]方法测定牦牛乳硬质干酪中NaCl的含量。

1.3.3 干酪pH值的测定

参考宋雪梅等[25]的方法，称取5 g干酪，加入10 mL蒸馏水混合、匀浆后，用pH计测定。

1.3.4 干酪中游离氨基酸总量的测定

参考Folkertsma等[26]的方法并适当修改。称取1 g干酪，加入9 mL蒸馏水，充分研磨，40 ℃水浴1 h，于3 000 r/min离心30 min后取上清液用快速滤纸过滤。取30 μL过滤液，用蒸馏水稀释至1 mL，加入2 mL镉-茚三酮溶液，84 ℃反应5 min。冷却后在507 nm处测定吸光度。以亮氨酸为标准品，绘制标准曲线，计算干酪中游离氨基酸含量。

1.3.5 干酪中生物胺的测定

参考Innocente等[27]方法。称取10 g干酪，加入20 mL 0.1 mol/L盐酸和100 μL 1 mg/mL 1,7-二氨基庚烷（内标）在50 mL离心管中，匀浆3 min。混合物在4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清液，用20 mL 0.1 mol/L盐酸再次提取残留物。合并两次提取的上清液，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至50 mL。

将1 mL生物胺标准品或样品、0.5 mL饱和碳酸氢钠和1 mL 50 mg/mL丹磺酰氯混合后涡旋1 min，在40 ℃遮光水浴中反应1 h。加入200 μL 100 mg/mLL-脯氨酸停止衍生反应，用1 mL乙醚提取2次，4 ℃、3 000 r/min离心10 min。将有机层转移至2 mL离心管中，用氮气吹至干燥。残留物溶解于1 mL乙腈中，经0.22 μm膜过滤，进行高效液相色谱分析。

高效液相色谱分析参考Moret等[28]方法并进行适当调整。色谱条件：Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；流动相：A为水，B为乙腈；梯度洗脱：0～10 min，35% A、65% B；10～21 min，20% A、80% B；21～30 min，0% A、100% B；紫外检测波长254 nm。

1.3.6 干酪中产胺微生物的筛选

参考谷静思[22]方法并略作修改。无菌条件下称取5 g干酪于50 mL灭菌离心管中，加入灭菌后的0.85%生理盐水45 mL，均质后，逐级稀释至合适的浓度梯度。取1 mL稀释液倒入培养皿中，然后在培养皿中倒入15～20 mL产胺微生物检测培养基，立即摇动使培养基和稀释液均匀分布。在37 ℃培养7 d后计数，紫色为阳性（产生物胺菌），黄色为阴性（不产生物胺菌）。将阳性菌用M17培养基纯化后进行革兰氏染色，通过显微镜观察鉴别菌株形态特征。每一浓度稀释液的培养基做一个对照培养皿，用灭菌生理盐水代替稀释液，以检查其无菌性和空气污染情况。

1.3.7 干酪中产胺微生物的测序鉴定

参考谷静思[22]的方法使用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）进行测序鉴定。25 μL PCR体系：2.5 μL 10×Buffer（含20 mmol/L Mg2+）、2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs、正、反向引物各1.5 μL、0.25 μL 5 U/μL ExTaqDNA聚合酶、2 μL DNA模板、16.75 μL无菌去离子水。细菌的引物为27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经0.8 g/100 mL琼脂糖凝胶电泳检测后，送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。登录NCBI数据库将所得序列与已知序列进行对比。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同盐添加量牦牛乳硬质干酪成熟过程中理化性质的变化

由图1A可知，相同成熟时间下，盐添加量为1.8%和2.3%的干酪中盐含量显著高于盐添加量为1.0%和1.3%的干酪（P＜0.05），这与Rulikowska等[9]研究结果一致。随着成熟时间的延长，不同盐添加量干酪中盐含量均呈现增加趋势；且在成熟4个月之后，4种不同盐添加量干酪中盐含量均差异显著（P＜0.05）。由于不同盐含量牦牛乳硬质干酪的制作工艺相同，因此，这表明后续各成熟时间下干酪的理化性质以及生化反应的变化均与不同盐添加量有关。由图1B可知，干酪pH值在0～1个月成熟过程中降低，在1～6个月成熟过程中逐渐升高。这是因为成熟初期，干酪中乳酸菌将乳糖转化为乳酸引起pH值降低；随着成熟进程的持续推进，干酪中非发酵剂乳酸菌进一步将乳酸分解为醋酸盐和CO2[29]，且干酪蛋白质也逐渐降解释放出碱性物质[30]，导致干酪pH值升高。此外，盐添加量为1.8%和2.3%的干酪pH值显著高于盐添加量为1.0%和1.3%的干酪（P＜0.05），Møller等[31]也发现切达干酪中盐添加量减少导致其干酪pH值降低。

图1 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中NaCl含量（A）和pH值（B）的影响Fig. 1 Effects of different salt content on NaCl content (A) and pH (B)during the maturation of yak milk hard cheese

2.2 不同盐添加量牦牛乳硬质干酪成熟过程中游离氨基酸总量的变化

图2 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中游离氨基酸总量的影响Fig. 2 Effects of different salt content on the total amount of free amino acids during the maturation of yak hard cheese

由图2可知，不同盐添加量的干酪在0～6个月成熟过程中游离氨基酸总量均显著增加（P＜0.05）。除未成熟干酪外，相同成熟时间干酪中游离氨基酸总量随着盐添加量的减少也随之降低，且盐添加量为1.8%和2.3%的干酪中游离氨基酸总量显著高于盐添加量为1.0%和1.3%的干酪（P＜0.05）。McCarthy等[32]研究发现，全脂切达干酪中盐含量由1.9%减少至0.9%时，干酪中游离氨基酸总量也出现了降低。

2.3 干酪成熟过程中生物胺含量的变化

2.3.1 生物胺标准品的色谱图和标准曲线

图3 生物胺标准品丹磺酰氯衍生物色谱图Fig. 3 Chromatogram of dansyl chloride derivatives of biogenic amine standard

由图3可知，生物胺衍生物分离效果好，峰形对称无拖尾，无杂质干扰，整个检测在22 min内完成。以生物胺标准品与内标的浓度之比作为自变量，其峰面积之比作为因变量，绘制标准曲线方程，结果如表1所示，各生物胺标准品衍生物标准曲线决定系数（R2）均大于0.99。

表1 生物胺的出峰时间、回归方程和R2Table 1 Peak times, regression equations and R2 of biogenic amines

2.3.2 干酪成熟过程中色胺含量的变化

图4 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中色胺的影响Fig. 4 Effects of different salt content on tryptamine content during the ripening of yak milk hard cheese

由图4可知，盐添加量分别为1.0%、1.3%、1.8%的牦牛乳硬质干酪中均检测到色胺，盐添加量为2.3%的干酪中未检测到。盐添加量为1.0%干酪，色胺在0～2个月成熟过程中先下降后上升变化缓慢，成熟2个月后，色胺含量整体呈增加趋势并在成熟5个月达到最大。盐添加量为1.3%干酪，色胺在0～6个月成熟过程中整体呈增加趋势。盐添加量1.8%的干酪，色胺在0～5个月成熟过程中呈现缓慢变化，成熟到6个月时，色胺含量显著增加到最大（P＜0.05）。以上情况表明不同盐添加量干酪中色胺含量最高形成阶段主要在成熟后期。在2～6个月成熟过程中，盐添加量为1.3%和1.8%干酪中色胺含量差异不显著（P＞0.05）。在5～6个月成熟过程中，盐添加量为1.0%和1.3%干酪中色胺含量差异不显著（P＞0.05）。不同成熟时间盐添加量为1.0%、1.3%和1.8%的牦牛乳硬质干酪中色胺含量为0.47～7.5 mg/kg。由于酪蛋白中色氨酸含量较低，导致干酪中前体氨基酸含量也低[33]，从而导致不同盐添加量牦牛乳硬质干酪中色胺含量最低。

2.3.3 干酪成熟过程中β-苯乙胺含量的变化

图5 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中β-苯乙胺的影响Fig. 5 Effects of different salt content on β-phenethylamine content during the maturation of yak milk hard cheese

由图5可知，在0个月时，盐添加量分别为1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的牦牛乳硬质干酪中β-苯乙胺含量相差甚微（P＞0.05）。在1～6个月成熟过程中，盐添加量为1.0%的牦牛乳硬质干酪中β-苯乙胺含量较低，但其含量整体高于色胺含量。在0～1个月成熟过程中，盐添加量为1.3%、1.8%和2.3%的干酪中β-苯乙胺增加；成熟到2个月时，盐添加量为1.3%的干酪中β-苯乙胺含量最高，但与盐添加量为2.3%的干酪相比差异不显著（P＞0.05）。

在3～6个月成熟过程中，盐添加量为1.3%、1.8%和2.3%干酪中β-苯乙胺含量整体呈现快速增加趋势；特别是盐添加量为2.3%干酪，β-苯乙胺含量显著高于盐添加量为1.0%、1.3%、1.8%干酪（P＜0.05）；盐添加量为1.0%干酪中β-苯乙胺含量最低。盐添加量分别为1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的牦牛乳硬质干酪中β-苯乙胺分别在成熟5个月或6个月达到最大。这说明不同盐添加量干酪中β-苯乙胺的积累阶段主要在成熟后期，且随着盐含量降低，干酪中β-苯乙胺含量呈现减少趋势。

2.3.4 干酪成熟过程中腐胺含量的变化

图6 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中腐胺的影响Fig. 6 The effects of different salt content on putrescine content during the maturation of yak milk hard cheese

腐胺主要是通过革兰氏阴性菌、Enterococcus等乳酸菌形成，经胍基丁胺或者鸟氨酸等代谢途经，形成过程复杂。由图6可知，在0～6个月成熟过程中，盐添加量为1.0%和1.3%的牦牛乳硬质干酪中未检测到腐胺。盐添加量为1.8%和2.3%的干酪在0个月时也未检测到腐胺。Bover-Cid等[34]发现更酸的环境抑制Lactobacillus curvatus产腐胺。本实验发现当盐添加量从2.3%减少到1.0%时，牦牛乳硬质干酪pH值降低（图1B），因此较低的pH值对干酪中腐胺形成具有抑制作用。在1～3个月成熟过程中，盐添加量为1.8%和2.3%的干酪中腐胺呈现增加趋势，在4～6个月成熟过程中，两种盐添加量干酪中腐胺呈现先减少后增加趋势。除了成熟4个月的干酪外，其余成熟阶段盐添加量为2.3%的干酪中腐胺含量显著高于盐添加量为1.8%干酪（P＞0.05）。一般而言，盐对革兰氏阴性菌的抑制程度强于革兰氏阳性菌。本实验中牦牛乳硬质干酪经真空包装避免了成熟过程中受到污染，因此干酪中腐胺的形成与革兰氏阳性菌相关程度较高。

2.3.5 干酪成熟过程中酪胺含量的变化

图7 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中酪胺的影响Fig. 7 Effects of different salt content on tyramine content during the maturation of yak milk hard cheese

除不同盐添加量的新鲜牦牛乳硬质干酪中未检测到酪胺外，盐添加量分别为1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的牦牛乳硬质干酪中在1～6个月成熟过程中均存在酪胺。由图7可知，在前2个月成熟过程中，盐添加量为1.0%干酪中酪胺含量增加不显著（P＞0.05），盐添加量为1.3%、1.8%和2.3%干酪中显著增加（P＜0.05）；从成熟第3个月开始，其含量整体呈现明显快速增长趋势。但是成熟4个月时，盐添加量1.3%、1.8%和2.3%的干酪中酪胺含量差异不显著（P＞0.05）；成熟6个月盐添加量为1.3%的干酪中酪胺含量最高，为49.81 mg/kg，显著高于盐添加量为2.3%的干酪（P＜0.05）。在2～6个月成熟过程中，盐添加量为1.0%的干酪中酪胺含量最低。结果表明，不同盐添加量干酪中酪胺积累主要在成熟后期，盐添加量为1.3%的干酪中酪胺含量较高。酪胺普遍存在于干酪，是毒性最强的生物胺之一，经酪氨酸脱羧酶作用于酪氨酸形成。过量摄入酪胺会导致机体血压升高、严重头痛、高血压以及心力衰竭[35]，对人体健康有影响的酪胺含量为100～800 mg/kg[36]。不同盐添加量干酪中酪胺含量远低于此标准。因此，盐添加量的调整未影响牦牛乳硬质干酪酪胺的安全剂量。

2.3.6 干酪成熟过程中尸胺含量的变化

图8 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中尸胺的影响Fig. 8 Effects of different salt content on cadaverine content during the maturation of yak milk hard cheese

由图8可知，盐添加量为1.0%的牦牛乳硬质干酪，在0～4个月成熟过程中，其尸胺含量无显著差异（P＞0.05），到第5个月时，含量达到最高且差异显著（P＞0.05）。盐添加量为1.3%的干酪在0～2个月成熟过程中其尸胺含量并无显著差异（P＞0.05），到第3个月时含量最高且差异显著（P＜0.05），在4～6个月成熟过程中无显著差异（P＞0.05）。盐添加量为1.8%干酪，在0～1个月成熟过程中尸胺呈现缓慢增加趋势，与盐添加量为1.0%、1.3%干酪中尸胺含量相比差异不显著（P＞0.05）；从第2个月起，盐添加量为1.8%干酪中尸胺较快增加，到第4个月时，含量达到最高。盐添加量为2.3%的干酪中尸胺在0～3个月成熟过程中呈现较快增加趋势，在4～6个月时，增加趋势变缓。在3～6个月成熟阶段，盐添加量为2.3%的干酪中尸胺显著高于盐添加量为1.0%、1.3%和1.8%的干酪（P＜0.05）。这些结果表明，不同盐添加量的干酪中尸胺的积累主要在成熟后期；当盐添加量低于1.3%时，盐含量对干酪中尸胺含量影响较小，当盐添加量在1.8%～2.3%时，随着盐含量的增加，干酪中尸胺含量整体增加。

2.3.7 干酪成熟过程中总生物胺含量的变化

图9 不同盐添加量对牦牛乳硬质干酪成熟过程中总生物胺的影响Fig. 9 Effect of different salt content on the total amount of biogenic amines during the maturation of yak milk hard cheese

牦牛乳硬质干酪中生物胺主要包含色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺和酪胺。由图9可知，盐添加量分别为1.0%、1.3%、1.8%和2.3%的干酪在1～6个月成熟过程中，生物胺总量整体呈现增加趋势。成熟到6个月时，2.3% NaCl添加量的干酪中生物胺总量是添加量为1.0%干酪的5.66 倍，是添加量为1.3%干酪的2.65 倍，是盐添加量为1.8%干酪的1.31 倍。总体来看，盐添加量为2.3%的牦牛乳硬质干酪中总生物胺含量最高（除未成熟和成熟4个月外），其次为盐添加量为1.8%、1.3%的干酪，盐添加量为1.0%的干酪中总生物胺含量最低。

干酪中生物胺主要通过微生物所含的脱羧酶作用于游离氨基酸形成。而盐通过影响微生物生长状态、酶活性、干酪pH值等进而对生物胺形成产生影响。生物胺是微生物适应酸性环境过程所产生的物质。然而，Pircher等[37]发现Enterobacteriaceae在低酸环境产尸胺的含量减少。Marcobal等[38]发现快速酸化可通过减少污染的革兰氏阴性微生物的生长而减少生物胺的产生。游离氨基酸是生物胺形成的前体物质，本研究发现盐添加量的减少导致牦牛乳硬质干酪中游离氨基酸含量减少和pH值降低（图1）。因此，低盐牦牛乳硬质干酪的较低pH值和较低游离氨基酸有助于减少其生物胺形成。

2.4 干酪中产胺微生物的筛选与鉴定

氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下生成胺和二氧化碳，pH值升高，含溴甲酚紫指示剂的培养基由黄色变为紫色。与对照组相比，含有牦牛乳硬质干酪样品的培养基中存在紫色菌落，初步判断存在阳性菌株即产生物胺菌。将产生物胺的菌落多次培养划线纯化后，挑取单菌落观察其菌落形态，发现菌落在培养基上生长状态较好，24 h培养后形成圆形菌落，灰白色，湿润隆起，有光泽。革兰氏染色显示为阳性球菌。通过分子生物学鉴定该株产胺菌为E. durans。

3 讨 论

本实验发现盐添加量分别为1.0%、1.3%的牦牛乳硬质干酪中生物胺主要为色胺、β-苯乙胺、尸胺和酪胺；盐添加量为1.8%的干酪中主要为色胺、β-苯乙胺、尸胺、腐胺和酪胺；盐添加量为2.3%的牦牛乳硬质干酪中生物胺主要为β-苯乙胺、腐胺、酪胺、尸胺。前人研究表明干酪中主要生物胺为酪胺、组胺、腐胺、尸胺和β-苯乙胺[39]，不同盐添加量牦牛乳硬质干酪中均不同程度地检测到大多数生物胺。盐添加量1.0%和1.3%的牦牛乳硬质干酪在成熟前2个月尸胺含量占总生物胺含量的比例最高，从成熟第3个月起，酪胺含量的占比最高，而盐添加量1.8%和2.3%的牦牛乳硬质干酪中腐胺含量比例较高，其次为尸胺含量。不同盐添加量干酪中生物胺积累阶段主要集中在成熟后期，这与之前发现的结果一致[24]。以上说明盐添加量的改变不影响干酪生物胺的形成，但盐添加量的改变影响了干酪中生物胺的种类和积累程度。

目前，乳制品中关于生物胺的含量并未做强行性限量规定，但与大多数食物中毒相关的生物胺主要为组胺和酪胺。成熟0～6个月，不同盐添加量牦牛乳硬质干酪中酪胺含量为3.13～49.81 mg/kg，远低于Ten Brink等[36]报告的酪胺最大耐受限度为100～800 mg/kg。不同盐添加量牦牛乳硬质干酪中均未检测到组胺，且生物胺总量最高为304.18 mg/kg。尸胺和腐胺一般认为没有毒性，但是它们可能会加强组胺和酪胺毒性。学者建议干酪中生物胺总量不应超过900 mg/kg[40]，因此，从生物胺角度来讲，盐添加量的改变对牦牛乳硬质干酪质量安全的影响有限。

干酪中盐对微生物生长繁殖的影响因菌株差异而不同。一般认为较高的盐浓度能够抑制细菌中某些菌株的生长或者脱羧酶活性[41]。然而，Buňková等[42]发现5 株乳酸乳球菌在含盐量2%的培养基上产生的酪氨酸高于含盐量1%的培养基，同时发现E. duransCCDM 53在较高的含盐量2%培养基上产生的酪胺含量高于含盐量1%培养基[43]。Bubelová等[44]发现在盐添加量为1%～3%且pH 5～7时，能够刺激Serratia marcescensCCM 303产生大量的腐胺和尸胺。此外，有研究发现当盐含量达到3%～6%时能抑制E. faecalis、Enterobacter等脱羧酶活性导致生物胺形成减少[45-46]。本实验所研究的不同盐添加量牦牛乳硬质干酪中盐含量在0.6%～1.7%之间，在这个盐含量较低的范围内，盐含量的增多促进生物胺增多。这是因为Na+参与维持细胞内pH值的稳态，在氨基酸脱羧途径中发挥重要作用，而且这些离子能够与从细胞中移除的氢离子进行交换，在钠/质子反转运系统中也很重要[47]。另外，研究表明，盐含量相同时，较弱酸性环境也可促进生物胺形成[45]。盐添加量为1.8%和2.3%的牦牛乳硬质干酪pH值较高（图1B），这强化了干酪中大多数生物胺的积累。因此，当盐添加量低于2.3%时，干酪中较低的游离氨酸含量和较低的pH值导致低盐牦牛乳硬质干酪中生物胺含量减少。

产胺微生物的存在是生物胺生物合成的必要条件，而且生物胺的形成在大多数情况下与菌株相关[48]。本实验从牦牛乳硬质干酪中筛选出一株产胺菌为E. durans。Enterococcus普遍存在于原料乳和乳制品中，大量干酪凝块和成熟干酪中也被报道存在[49]。Ladero等[50]研究发现巴氏杀菌并不能完全将Enterococcus杀灭。Enterococcus在pH 3.8～4.5的酸性希腊干酪或者成熟的酸凝干酪中的生长受到抑制[51]，而在碱性环境中能够生长，在乳制品中产生大量生物胺[52]。Galgano等[53]从Semicotto Caprino干酪中筛选的Enterococcus具有较强的产酪胺和苯乙胺的能力。Li Jing等[54]从西藏传统发酵牦牛乳中分离的5种E. durans存在宽泛的脱羧酶能力，大多数能够产酪胺、腐胺等。Ladero等[55]发现Enterococcus产腐胺和酪胺是物种特性。食品中发现的Enterococcus种类主要有E. faecalis、Enterococcus faecium、E. durans和Enterococcus casseliflavus[56]。本实验在牦牛乳硬质干酪中鉴定出的为E. durans。Enterococcus对牦牛乳硬质干酪中生物胺的形成起重要作用，但是生物胺的形成非常复杂，既依赖于微生物种类，也与微生物生长动态、蛋白质降解以及脱羧酶活性等相关，后续需进一步加大对产胺微生物的识别、Enterococcus生长和产胺特性的分析，为进一步控制干酪中生物胺形成提供一定理论依据。

4 结 论

不同盐添加量牦牛乳硬质干酪中生物胺主要为色胺、β-苯乙胺、尸胺、酪胺和腐胺，未检测到组胺，生物胺积累阶段主要集中在成熟后期。不同盐添加量干酪中色胺含量最低，且在成熟后期含量差异较小。当盐添加量从2.3%减少到1.0%时，干酪中β-苯乙胺含量减少。盐添加量分别为1.0%和1.3%时，干酪中尸胺含量较低，且未检测出腐胺。当盐添加量在1.8%～2.3%时，随着盐含量的增加，干酪中尸胺和腐胺含量整体呈现增加趋势。不同盐添加量的干酪成熟过程中，酪胺含量范围为3.13～49.81 mg/kg，且生物胺总量最高为304.18 mg/kg。经显色培养基筛选，分子生物学鉴定出一株产胺微生物为E. durans。该研究为开发低盐牦牛乳硬质干酪提供了一定理论支持。