miR-451、miR-133a-3p、miR-96在胃癌组织中的表达及意义*

刘丽丹, 蒋先明, 应茜茜, 乐晓伟, 尤光贤

台州市肿瘤医院放疗科(浙江台州 317502)

临床医学将原发于机体胃黏膜上皮组织的恶性肿瘤定义为胃癌，因其高发病率、高病死率的特点而位居十大恶性肿瘤之首[1-2]。据相关流行病学调查数据显示，我国胃癌症状发病具有明显的性别、地域差异性，中老年男性为胃癌症状高发群体，近年来，随着社会发展，人们生活习惯、压力的变化，我国胃癌发病率连年上升，并呈现年轻化趋势，引起广大专家学者的关注[3-4]。胃癌症状早期并无特异性临床表现，致使胃癌早期诊断率较低，随着胃癌症状不断发生演进，病情不断恶化，对患者临床治疗、预后造成严重影响，因此在发病早期对胃癌进行及时的诊断、治疗对患者病情恢复、预后改善具有重要意义[5-6]。本研究中对胃癌患者手术切除癌组织标本中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达水平进行检测，旨在探究三者表达变化与胃癌病理特征之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年11月至2020年11月于我院进行手术治疗的胃癌患者93例，包括男51例，女42例，年龄53～68岁，平均(60.5±5.9)岁。其中包括淋巴结转移49例，无淋巴结转移44例；浸润情况：黏膜层浸润66例，浆膜层浸润27例；病理分期：Ⅰ期患者42例，Ⅱ期患者28例，Ⅲ期患者17例，Ⅳ期患者6例；癌组织分化程度：高分化62例，中分化19例，低分化12例。本研究所有患者及家属均知情同意，并获我院伦理委员会批准(编号：2019-XM-3)。

纳入标准：均符合中华医学会对胃癌诊断标准[7]，首次确诊，病历资料齐全。

排除标准：(1)接受放化疗等治疗者；(2)重度高血压、心脏病患者；(3)肝肾功能障碍者；(4)手术禁忌证患者；(5)并发其他恶性肿瘤患者；(6)精神异常者。

1.2 方法

1.2.1 标本采集、免疫组化染色 收取患者手术切除癌组织、距癌组织5 cm癌旁组织制作标本进行固定、石蜡包埋处理，3 μm厚度连续切片，切片脱蜡、水化后清洗3次，3 min/次，之后使用100℃枸橼酸缓冲液(0.01 mol/L)浸泡修复，15 min后取出冷却，PBS液清洗。滴加POD阻断剂，室温培养0.5 h后PBS清洗3次，滴加山羊血清，26℃环境中培养0.5 h，滴加一抗后过夜孵育，取出后PBS液清洗，滴加二抗，常温孵育，30 min后使用PBS清洗，添加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液后再次培养30 min，PBS液清洗，滴加DAB溶液后苏木精染核，反蓝、脱水处理后封片。

1.2.2 miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达检测 RT-PCR检测miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达。提取细胞总RNA并对纯度、含量进行检测，逆转录处理，2-ΔΔCt方法计算，内参U6。U6引物序列：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-451引物序列：上游引物：5′-CCGCTCGAGCCGGCCTTC-CAACCTTTGTC-3′,下游引物：5′-GAATGCGGCCGCTCCCATCATCAAT-ATTTATTGAGCATTTAC-3′。miR-133a-3p引物序列：上游引物：5′-CGAGCCTTTGGTCCCCTTCAAC-3′,下游引物：5′-TCAACTGCTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′。miR-96引物序列：上游引物：5′-AATGCGGGGCTAGGGCTA-3′,下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

2 结果

2.1 癌组织、癌旁组织中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达水平比较 癌组织中miR-451、miR-133a-3p表达水平低于癌旁组织，miR-96表达水平高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.001)。见表1和图1～2。

表1 癌组织、癌旁组织中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达比较

注：A:miR-451; B:miR-133a-3p; C:miR-96

注：A:miR-451; B:miR-133a-3p; C:miR-96

2.2 不同性别、年龄胃癌患者miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达比较 不同性别(男、女)、年龄(>60岁、≤60岁)患者癌组织中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同性别、年龄胃癌患者miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达比较

2.3 不同病理特征患者miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达比较 有淋巴结转移患者miR-451、miR-133a-3p表达水平低于无淋巴结转移患者，miR-96表达水平高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)；与黏膜层浸润患者相比，浆膜层浸润患者miR-451、miR-133a-3p表达水平较低，miR-96表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者miR-451、miR-133a-3p表达水平低于Ⅰ、Ⅱ期患者，miR-96表达水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)；与高分化患者相比，中、低分化胃癌患者miR-451、miR-133a-3p表达水平较低，miR-96表达水平较高，与中分化患者相比，低分化胃癌患者miR-451、miR-133a-3p表达水平较低，miR-96表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达与胃癌患者病理特征的关系

2.4 胃癌癌组织中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达相关性 胃癌组织中miR-451、miR-133a-3p表达水平呈正相关(r=0.262，P=0.011)；miR-451、miR-96表达水平呈负相关(r=-0.228，P=0.028)；miR-133a-3p、miR-96表达水平呈负相关(r=-0.301，P=0.003)。见图3。

图3 胃癌癌组织中miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达相关性

3 讨论

据世卫组织调查数据显示，胃癌发病率、病死率在所有恶性肿瘤中排名居于前两位，因其较高的恶性程度导致治疗难度大、患者预后差[8-9]。中老年男性为胃癌症状高发群体，并逐渐出现年轻化趋势，胃癌发病前期无特异性表现，随着病情进展，患者大多表现为消化道出血、上腹部疼痛等，严重影响患者健康和预后[10-11]。胃癌症状发病的常见病因包括生活饮食习惯、遗传、癌前病变等，但是目前临床医学尚未将胃癌病理机制研究透彻，越来越多的专家学者开始通过分子生物学、基础医学等途径对胃癌发病机制进行研究[12-13]。

微小RNA(miRNA)广泛存在于多数生物体之中，miRNA表达变化与微生物感染、炎症反应及机体免疫状态等病理学改变均具有一定相关性。大量研究结果表明，miRNA家族成员与细胞凋亡、增殖、神经元发育等生物学行为具有密切联系。因miRNA具有组织特异性、稳定性、保守性的特点，具有一定的促癌、抑癌特性，在肿瘤组织发生演进过程中具有重要作用，因此许多专家学者通过检测miRNA表达对恶性肿瘤进行诊断[14-15]。

miR-451是一个多功能且双顺反子的miRNA基因位点，是在红细胞进行发育过程中呈现特异高表达的miRNA分子,而miR-451基因簇高度保守，其存在的区域位于组织内较为脆弱的区域，其中涵盖的miRNA分子之间存在紧密相关性[16]。据行相关研究表明[17]，miR-451在消化道疾病中以低表达状态存在。由此可认为，miR-451可能与胃癌、食管癌等消化道疾病之间具有紧密关联，可能参与该疾病发生、发展的全过程。在此基础上，本研究发现，miR-451在胃癌中呈现低表达状态，能够对肿瘤的发展产生重要影响。而本文所得出的这一结果与上述相关研究结果保持一致。分析原因，miR-451可能通过对某种信号通路的活性进行调控，从而导致胃癌细胞的增殖、侵袭的情况出现异常，从而造成胃癌病情的恶性进展。可见，上调miR-451表达可能是控制胃癌进一步发展的关键。

miR-133a-3p以一种机体肌肉特异性的miRNA形态存在，分别位于6p12.2、18q11.2和20q13.33这3个不同的染色体上，miR-133a-3p的存在能够对运动相关基因产生靶向调控作用，有利于骨骼肌受损后的再生，以及肌肉的再生[18]。据行相关研究表明[19]，miR-133a-3p在多种肿瘤疾病中呈现出异常低表达，并且能够对机体多种SGC7901等多种肿瘤细胞进行靶向调控，促进肿瘤疾病的进一步发展，与肿瘤疾病之间具有紧密关联。在此基础上，本研究发现，miR-133a-3p在胃癌中呈现低表达状态，能够对于肿瘤疾病的发生发展产生重要促进作用。而本文所得出的这一结果与上述相关研究结果保持一致。分析原因，可能是因为miR-133a-3p能够抑制阻断细胞自噬介导谷氨酰分解，从而对胃癌细胞 的增殖和侵袭进行抑制，从而造成疾病的进一步发展。

miR-96位于染色体7q32.2上，miR-96分子为PTPN9的上游分子，能够促进癌细胞的增殖、侵袭、迁移，起到靶向调控的作用[20]。据相关研究指出[21]，miR-96能够与K-ras癌基因进行直接靶向结合，从而对胰腺癌细胞的侵袭和迁移进行抑制，缩减肿瘤细胞的生长速度。还有研究表明[22]，在肿瘤疾病中，miR-96呈现出异常高表达，由此可认为，miR-96可能与胃癌等多种肿瘤等疾病的发生具有紧密关联，可能参与疾病病情发展的全过程。在此基础上，本研究发现，miR-96在胃癌中呈现高表达状态，对肿瘤的发展产生重要影响。与该上述相关研究结果保持一致。分析原因，miR-96能够对胃癌细胞的转录及表达水平进行增强，并且增强胃癌细胞的恶性增殖以及侵袭，促进胃癌的进一步发展，从而严重影响患者预后情况。

综上所述，miR-451、miR-133a-3p、miR-96在胃癌组织中呈现异常表达，且miR-451、miR-133a-3p、miR-96表达变化与胃癌患者淋巴结转移情况、浸润程度、TNM分期、分化程度相关，三者表达之间具有一定相关性，共同参与胃癌发展演进过程。但因本文研究样本量较小，并且未对胃癌患者的相关预后进行分析，缺乏对相关性的深入研究，需进一步增加样本量进行多方研究证实。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：刘丽丹、尤光贤：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；蒋先明：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；应茜茜、乐晓伟：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改。