胃癌组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平变化及与患者临床分期和预后的关系*

贾旻蕾，刘瑞丽，李兰军

河北省邯郸市第一医院普外三科，河北邯郸 056002

胃癌(GC)是全球范围内最常见的肿瘤之一，研究数据显示，2018年全球有超过100万的GC新发病例，至2020年我国GC发病率约为24.30/10万，新发病例约为34.6万，总病死病例超过37万[1-2]。尽管随着诊疗技术的不断进步，GC患者生存期逐渐延长，但GC发生、发展的分子机制尚未完全明确，患者5年生存率仍处于较低水平[3-4]。长链非编码RNA(lncRNA)母系表达基因3(MEG3)是第一个被发现的具有抑癌基因活性的lncRNA家族成员，相关研究表明，肝细胞癌、前列腺癌组织中lncRNA MEG3表达缺失，而lncRNA MEG3表达缺失有利于肿瘤血管新生，促进肿瘤组织恶性演变[5-6]。微小RNA(miR)-7-5p是位于9q21染色体上的一种核糖核酸，研究证实，其在非小细胞肺癌等低放射敏感性的肿瘤细胞内表达上调，其表达水平可能与肿瘤治疗反应性有关[7]。本研究对GC组织中lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平变化及与患者临床分期及预后的关系进行了探讨，以期为临床诊疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2019年12月本院收治的104例GC患者为研究对象，将患者的GC组织标本作为GC组，对应的癌旁组织标本作为癌旁组织组，另选取同期52例行手术治疗的胃良性肿瘤患者的肿瘤组织标本作为良性肿瘤组。 104例GC患者中临床分期Ⅰ期28例，Ⅱ期36例，Ⅲ期26例，Ⅳ期14例。纳入标准：(1)GC组患者符合GC诊断标准[8]，良性肿瘤组患者符合胃良性肿瘤的诊断标准[9]；(2)患者均为首次确诊，入组前未经手术、放化疗等任何相关治疗；(3)原发性肿瘤；(4)GC患者病理检查诊断为腺癌；(5)GC患者经评估可实现R0切除或需行姑息性切除术；(6)预计生存期>3个月。排除标准：(1)合并其他类型肿瘤；(2)伴肝、肾、心等重要器官功能障碍；(3)卡氏评分(KPS评分)<70分，不耐受手术者；(4)有腹部手术史者。GC组与良性肿瘤组患者性别、年龄、体质量指数(BMI)、饮食习惯、吸烟史、饮酒史比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经本院医学伦理委员会审批通过，研究对象对研究内容知情同意，并签署知情同意书。

表1 GC组与良性肿瘤组患者一般资料比较

1.2方法 取手术收集的标本100 mg置于研磨器中，加Trizol试剂1 mL，研磨器置于液氮中研磨，静置5 min，提取总RNA，参照加拿大Fermentas公司生产的反转录试剂盒说明书合成cDNA，检测纯度后液氮保存待用。引物由金斯瑞生物科技有限公司提供。lncRNA MEG3上游引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，下游引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；miR-7-5p上游引物5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUU-3′，下游引物5′-CAACAAAAUCACUAGUCUUCCAUU-3′。反应条件：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，设置3个复孔。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平。

1.3观察指标 (1)对比3组lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平。(2)对比不同临床分期GC患者GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平，并分析GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平与患者临床分期的相关性。(3)分析GC患者临床分期的影响因素。(4)随访24个月，比较GC组织不同lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平患者的生存情况。

2 结 果

2.1GC组、癌旁组织组、良性肿瘤组lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平比较 GC组lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平低于癌旁组织组、良性肿瘤组，癌旁组织组lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平高于良性肿瘤组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.2GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平与患者临床分期的关系 不同临床分期患者GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，随着临床分期的进展，GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平呈降低趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。Spearman相关分析结果显示，GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平与患者临床分期均呈负相关(r=-0.527、-0.501，P<0.05)。

2.3影响GC患者临床分期的单因素分析 不同临床分期GC患者性别、年龄、BMI、饮食习惯、吸烟史、饮酒史、肿瘤最大径、肿瘤位置、脉管癌栓情况、神经浸润情况、肿瘤类型比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同临床分期GC患者组织分化程度、合并胃溃疡情况、浸润深度比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表2 GC组、癌旁组织组、良性肿瘤组lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平比较

表3 不同临床分期患者GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平比较

表4 影响GC患者临床分期的单因素分析结果[n(%)或

续表4 影响GC患者临床分期的单因素分析结果[n(%)或

2.4影响GC患者临床分期的多因素Logistic回归分析 以临床分期作为因变量，以表3、表4中差异有统计学意义的指标作为自变量进行多因素Logistic回归分析，变量赋值情况见表5。结果显示，GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平为GC患者临床分期的影响因素(P<0.05)。见表6。

表5 变量赋值情况

2.5GC组织不同lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平患者生存情况比较 对GC患者随访24个月，期间失访3例，死亡21例，生存80例。分别以GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p表达水平均值为界分组，>均值为高表达，≤均值为低表达。Kaplan-Meier生存分析结果显示，lncRNA MEG3高表达患者生存率高于lncRNA MEG3低表达患者(χ2=5.344，P=0.021)；miR-7-5p高表达患者生存率高于miR-7-5p低表达患者(χ2=5.208，P=0.023)。生存曲线见图1、图2。

表6 影响GC患者临床分期的多因素Logistic回归分析结果

图1 GC组织不同lncRNA MEG3表达水平患者生存情况

图2 GC组织不同miR-7-5p表达水平患者生存情况

3 讨 论

GC发病机制复杂，病因也尚未完全明确，超过90%的GC病理类型为腺癌，GC早期缺乏典型症状，多数患者就诊时已是中、晚期[10-11]。积极探明GC发生、发展相关分子机制是指导临床完善治疗方案、提升患者治疗效果的关键。

近年来有关GC预后的研究主要集中在血清学指标，有研究发现，糖类抗原19-9、癌胚抗原等肿瘤标志物对评估GC患者病情转归具有一定临床参考价值，但限于GC发生、发展机制复杂的特征，总体评估效果并不理想[10]。随着对基因组学研究的不断深入，发现基因组序列中仅2%可被翻译为蛋白质，其余大部分转录成非编码RAN，lncRNA是转录本长度超过200个核苷酸的一类RNA分子的总称，其与转录、表观遗传等的调控有关，且与肿瘤发生、发展也有一定关系。lncRNA MEG3是定位在染色体14q32.3上的长度为1.6 kb的一种小鼠母系印记基因GTL2人类同系物，生理状态下其在卵巢、脑等组织内高表达[12-13]。有研究证实，敲除lncRNA MEG3可强化胰腺癌细胞增殖活力及侵袭、迁移能力，且lncRNA MEG3低表达会增加中年人群结直肠癌的发生风险[14]。本研究结果显示，GC组织中lncRNA MEG3表达水平明显低于癌旁组织及胃良性肿瘤组织(P<0.05)，分析出现该结果的原因如下：(1)lncRNA MEG3可与蛋白编码基因上游启动子区域结合而影响下游基因表达；(2)lncRNA MEG3能抑制RNA聚合酶Ⅱ或调节染色质重构、组蛋白修饰，调控下游基因表达；(3)lncRNA MEG3与蛋白基因转录本结合形成互补双链，影响mRNA剪切；(4)lncRNA MEG3与蛋白基因转录本结合形成互补双链后在Dicer酶作用下生成内源性siRNA，继而调节基因表达[15-16]。lncRNA MEG3通过上述转录调控、蛋白修饰及染色质重塑等多个层面调控靶基因表达，发挥生物学效应，当其表达水平降低时可直接造成对应基因表达调控机制失衡，甚至引起细胞无序增殖、生长。因此，GC发生、发展可能与lncRNA MEG3表达水平异常有关。进一步经Spearman相关分析结果显示，GC组织lncRNA MEG3表达水平与患者临床分期呈负相关(P<0.05)，提示lncRNA MEG3表达水平降低可增强肿瘤恶性生物学行为。本研究多因素Logistic回归分析结果显示，GC组织lncRNA MEG3表达水平是患者临床分期的影响因素，lncRNA MEG3可能在GC发生、发展中发挥抑癌基因活性。有研究发现，脉管癌栓情况、分化程度等均是GC患者临床分期的影响因素[17-18]，但本研究未得出类似结论，可能与纳入研究的样本量、样本选择不同有关。

研究证实，miR-7-5p能通过靶向基因抑制结直肠癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，且能提高耐药肿瘤细胞的敏感性[19-21]。本研究发现，GC组织中miR-7-5p表达水平明显低于癌旁组织及胃良性肿瘤组织(P<0.05)，提示miR-7-5p可能与lncRNA MEG3具有相同的生物学活性。相关研究显示，miR-7-5p可通过Kruppel样因子4/磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶/p21通路扼制前列腺癌干细胞样特性[22]。推测miR-7-5p也可能通过调控GC细胞生物学功能而实现抗肿瘤作用。本研究相关性分析发现，GC组织miR-7-5p表达水平与患者临床分期呈负相关(P<0.05)。分析出现该结果可能与以下机制有关：miR-7-5p能抑制GC细胞内表皮生长因子受体表达，进而阻断GC细胞的侵袭及迁移，另外，miR-7-5p可通过靶向抑制REGγ表达阻断细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖，而在GC细胞内REGγ同样是miR-7-5p的靶基因，其能高度特异性抑制GC细胞增殖，而肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移是临床分期进展的主要特征。此外，本研究随访发现，GC组织lncRNA MEG3、miR-7-5p高表达患者生存率高于低表达患者，提示lncRNA MEG3、miR-7-5p与GC患者的预后有关，可作为判断患者生存情况的重要指标。

综上所述，GC组织中lncRNA MEG3、miR-7-5p水平呈异常低表达，且表达水平越低的患者临床分期越高，预后相对更差，lncRNA MEG3、miR-7-5p可作为GC病情及预后评估的参考指标。