环状RNA在卵巢癌中的研究进展

王冠 张惠晶 王爽 段丽 邢焱玲 王莉莉 李佩玲

作者单位：1 黑龙江省医院妇产科，黑龙江 哈尔滨 150000；2 哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，黑龙江 哈尔滨 150000

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是妇科恶性肿瘤中病死率最高的疾病，每年有超过20 万例的新增诊断病例。据报道，中国卵巢癌患者的5 年生存率在2005—2014 年变化甚微，低至30%，60%的患者在最初诊断时已处于卵巢癌Ⅲ期至卵巢癌Ⅳ期，复发和转移率高，难以在疾病早期进行诊断[1]。肿瘤细胞减灭术和辅以铂类为主的联合化疗，是目前OC 标准化治疗的主要方法。缺少有效的预防措施、早期治疗的困难和化疗耐药而引起的复发都是造成低水平总生存期（overall survival，OS）的主要因素。OC 的发生与组织中基因的表达改变有关，这些基因调控着肿瘤细胞的生长和转移，是肿瘤恶性进展的关键因子。上述原因，使得寻找用于OC 诊断与预后预测的潜在生物标记，以及发现新的医学治疗靶点的任务越来越紧迫。文章主要就环状RNA（circular RNA，circRNA）的分子特征、在恶性肿瘤中发挥的作用、其作为OC 生物标志物的可行性，以及其作为内源性RNA 吸附微小RNA（microRNA，miRNA），上调miRNA 靶基因的表达，间接参与OC 的发生、发展过程作一综述。

1 circRNA 分子概述

人类基因组计划显示，约3 万条人类基因组能够完成蛋白质的编码。此比例在人类基因组序列的总数中不超过3%。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）一直被认为是不能编码蛋白质的“垃圾区域”。事实上，非编码RNA 与人类疾病关系密切，在正常生理水平和病理状态下进行非编码RNA 机制的研究。在正常生理水平和病理状态下进行ncRNA 机制的研究，能够为广大医务工作者在疾病早期诊断和治疗中，提供新的思路和理论依据。

研究结果表明，ncRNA 中的circRNA 并不具有直接编码蛋白质的功能，在人身体的不同组织中广泛表达。其在恶性肿瘤组织与细胞中异常表现，同恶性肿瘤的产生和进展之间也存在着联系，已被证实在临床中具有潜在的应用前景。科研人员们希望通过对circRNA 作用机制的深入研究，能够进一步揭开恶性肿瘤发生发展的潜在机制，进而给恶性肿瘤的预防与治疗带来全新的思考。早在20 世纪70 年代，circRNA 就已第一次在电子显微镜下观察病毒时被发现了。circRNA 是非编码RNA 族中最晚发现的RNA，主要来自前体信使RNA（precursor messenger RNA，pre-mRNA），是广泛分布于所有真核生物中的新型内源性RNA。和传统的线性RNA 结构不同，它一般是在进行蛋白质编码外显子时，因经过相反方向的剪接，形成了连结于3’和5’末端上的共价键结构。如与Alu 元件或RNA的结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs），比如震动蛋白（quaking protein，QKI Protein），即可产生circRNA[2]。

2 circRNA 的生物学特性

按照circRNA 的小分子、亚细胞定位构造及其他的环化共价键等化学结构的特征，circRNA 主要包括以下4 个类型：（1）外显子circRNA（exonic circular RNAs，ecircRNA），是通过外显子的反向拼接而成的。通过其上的内含子连接而形成的环化，或通过套索结构而进行环化以及外显子的跳跃，如具有互补序列，就可以直接进行碱基配对成环，并进行剪接生成circRNA，最终形成外显子来源circRNA。外显子来源的circRNA 主要分布在细胞胞浆中，并具备与miRNA 结合的化学元件，已被证实在被转录后，调控基因表达，并在恶性肿瘤组织中发挥重要功能。（2）内含子来源的circRNA（intronic RNA，ciRNA），可分为Ⅰ类和Ⅱ类。线性内含子通过与其末端的鸟苷酸2'羟基健融合，从而接近了3’末端的磷酸二酯键，最终取而代之，环化成RNA。（3）外显子-内含子circRNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA），其形成机制类似于ecircRNA。不同之处在于，RBP 能够对部分EIciRNA 进行调控。RBP 还能够通过结合上下游附近的ciRNA，进而使内含子间距大大缩短，以实现对EIciRNA 的调节。可能参与了基因的调控、转录以及选择性剪切。（4）通读环状RNA （read- through circRNA，rtcircRNA）。circRNA 有如下生物学特性：（1）表达的丰度差别很大：在人组织、血液及外泌体中均能检测到circRNA 的表达。有研究团队曾报道，circRNA 在人体的成纤维细胞中，已出现过25 000 种之多，在人脑组织中，超过65 731 种circRNA通过高通量检测被发现[3]。某些circRNA 的表达量是一般线性RNA 的10～20 倍以上，circRNA 可能是比mRNA 更加主要的转录本。（2）结构稳定性：由于所有circRNA 都具有共价的闭合环构造，而无5’端帽子结构和3’端多聚体A 尾构造，使之可以有效抵抗核糖核酸酶的分解，而不宜被核酸外切酶所剪切。而与之相对应的线性RNA 的半衰期一般少于20 h。（3）保守特征：circRNA 在不同类型的生物种类间，也表现出了高度进化的保守特性。有学者在对人与老鼠circRNA 的比较研究表明，circRNA 的表达仅占直系同源基因的4%。表明circRNA可能在转录水平产生主要影响[4]。因此它可被认为是疾病诊断的理想生物标记物之一，需要进一步的科学研究来证实。（4）特异性：比如在乳腺癌细胞系MCF-7 中，发现circ-DOCK1 呈现相对高表达水平，但是它在肺癌细胞系A549 中，却未发现异常表达[5]。

3 circRNA 的功能

近年来，有关于circRNA 作用功能的研究成果较多。circRNA 能够调控其他类型RNA，通过基因互作网络的建立，来调控靶基因的表达。多数研究结果证明它主要在以下几个方面发挥了生物学功能：（1）作为竞争内源性RNA 结合miRNA，以调控靶基因的表达[6]。由于circRNA 分子富含与miRNA 相结合的碱基互补位点，因此通过与相应的miRNA 结合，能够消除miRNA 对其相应的靶基因mRNA 的调控，此过程使靶基因mRNA 的表达水平提高，进而实现了在转录水平上对靶基因的控制。另外，根据既往报道，大部分的circRNA 分布于细胞胞浆中。这为circRNA 能够吸附于miRNA 家族，并作为miRNA 的海绵，提供了理论基础。（2）circRNA 可以调节premRNA 的剪接。ecircRNA 可以调节pre-mRNA 选择性剪接或能够经与其对应的线性RNA 相互竞争，而抑制其亲本基因的表达，两者之间呈现出负性相关。（3）circRNA 能够对亲本基因进行调控。近期的科学研究也证实，circRNA 能在RNA 聚合酶Ⅱ的作用下调节亲本基因[7]。可以在与RNA 聚合酶Ⅱ复合体进行连接后，加速基因转录，由此达到对自身编码基因转录活性进行调节的目的。（4）circRNA 与蛋白质的相互作用：研究表明，circRNA 能够与RBP 形成RNA-蛋白复合物，从而调控RBP，作用于靶基因发挥的生物效能[8]。或者circRNA 可以通过与部分碱基互补匹配的方法，间接完成了对靶基因的控制。另外，circRNA 也可以通过与其相关的蛋白质形成关系，对蛋白质的功能形成影响，但此过程需要通过RNA 介导。（5）翻译功能：大多数学者认为，circRNA 不具备翻译功能。但是，它可以通过与mRNA 竞争性地结合RBP 碱基互补位点来调节翻译的过程。另外，部分环状RNA，可以通过内部核糖体进入位点结合到核糖体上，插入并合成circRNA 之后，就可以翻译蛋白。

4 circRNA 在肿瘤发生发展中的作用

二十年来，高通量测序、RNA 提取、PCR 及蛋白印迹等技术手段，推动了分子生物学的快速进展。研究者们对关于circRNA 在人类肿瘤中的产生和进展，及对其功能的认识，也正是通过对被鉴定识别的circRNA 数量的提高和对其功能方面的深入研究，才能完成。有许多研究人员通过上述分子生物技术都检测到了circRNA 的异常表达。如在乳腺癌、肺癌、胶质瘤及胰腺癌等的恶性组织中的circRNA 和相对应的正常组织和/或癌旁组织，均具有不同表现。有关研究的论文报道量也在逐渐递增，其功能机理也越来越清晰。circRNA 的相对稳定性强，高特异率，含量丰富，在癌症组织与正常组织中具有显著的表达差异等特点，是未来作为恶性肿瘤早期诊断的较为理想的生物标记物。目前的研究成果已经证明，circ-0000190 可能是一个全新的无创胃癌检测生物标记物，其敏感度和特异性程度都高于临床上用于常规肿瘤检测的CEA、CA-199 等[9]。circ-0013958 可作为无创生物标记物，对肺腺癌进行早期检测和筛查。有研究人员证明了circRNA 与miRNA 之间的主要作用方式是由于circRNA 中具有许多与miRNA 家族碱基序列互补匹配的结合位点，可成为miRNA 的分子内“海绵”[10]。当miRNA 分子像“海绵”那样被circRNA 所吸收后，miRNA 失去对靶基因作用，从而使得miRNA 的靶基因表达水平显著提高，间接地参与了许多恶性肿瘤的发生、进展等过程。研究表明circRNA 可能是与miRNA 竞争的ceRNAs，以调控基因表达和变异[11]。例如，circABCC2 通过浸润miR-665 促进肝癌的进展[12]。circHECTD1 通过靶向miR-1256 和激活catenin/MYC 通路促进胃癌发展[13]。在恶性肿瘤产生与发展的过程中，circRNA 主要是通过影响恶性肿瘤细胞的生长发育、上皮间充质转化等步骤控制恶性肿瘤细胞的发育生物学活动[14]。其中，上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一种转化过程，是肿瘤形成中的关键步骤，可将上皮来源的细胞驱动为恶性肿瘤。circRNA 可以通过影响MAPK/ERK 通道、影响PI3K/AKT 通道，以及影响周期的调控点等来控制肿瘤细胞生长。如在PI3K/AKT 途径中，配体通过和接受器酪氨酸激酶的结合，活化了PI3K，从而使得AKT 被磷酸化，以促使细胞的正常生长。在这一过程中，CDR1as 和circNT5E通过促进PI3K 的表达，来控制肝癌细胞的正常生长进程[15]。ciRS-7 消除miR-135a-5p 对胃癌的抑瘤作用，也是通过该信号通路[16]。根据Shuai 等[17]的报告研究成果，circ-0000285 很可能会是鼻咽癌患者预后的一个独立因素，提示了circ-0000285或许是鼻咽癌的一个新的生物标记物，并和鼻咽癌对放疗的效果是否敏感有重要关系。类似的，也有研究报告指出，circ-HIPK3 分泌量，同时还能作为鼻咽癌患者预后的1 个指标[18]。

5 circRNA 在OC 中研究进展

近年来，有关circRNA 在妇科恶性肿瘤中的研究也越来越多，现将circRNA 在OC 中的相关研究汇总如下。

目前在卵巢癌中发现了较多异常表达的circRNAs。Ahmed等[19]运用高通量测序的方法，对3 例晚期OC 原发病灶组织、腹膜转移病灶组织以及淋巴结转移病灶组织进行了全面的circRNA 测定。结果显示，在OC 中，可检测和鉴定出数万种circRNA 的表达异常。在OC 原发癌灶小组中，circRNA的相对表达水平也远高于其所对应的线性mRNA。相关文章报道，对于那些和肿瘤相关的生物信号通道，例如TGF-β、NF-κB 等。因为线性mRNA 及circRNA 有共同表达的趋势，产生了完全相悖的表现形式。而circRNA 的高稳定表达，为肿瘤诊断、治疗和预后，提出了高效的、完整的候选分子。为了探讨OC 中circRNA 的表达谱，Ning 等[20]共收集54 例卵巢癌标本和54 例正常卵巢组织。与正常妇女卵巢组相比，共4 000 多个circRNA 在EOC 组中的表达升高，差异明显。另外，有两千多个circRNA 在EOC 组中的表达上升，另有1 800多个circRNA 表达下降。Guan 等[21]证实，circ-ANKRD12 在SKOV3 中的表达高于卵巢正常上皮细胞。在SKOV3 和A2780细胞中，ANKRD12 沉默后，细胞的侵袭和迁移过程被抑制。Zhao 等[22]研究成果表明，circRNA-MYLK 的低表达与卵巢癌患者的预后不良有关。此外，circ-ITCH 与EOC 的TNM 分级、卵巢癌病灶大小以及FIGO 的分期呈负性相关，而与OS 呈正性相关，起到抑癌效果[23]。研究表明，circ-HIPK3 在卵巢癌组织中，表达异常升高，与卵巢癌的预后不良相关[24]。有研究发现，circ-0051240 在卵巢癌组织中，表达异常升高，体内移植肿瘤的发育也受到很大程度的抑制[25]。Chen 等[26]的研究结果显示，在沉默circ-NOLC1 后，卵巢癌细胞的侵袭能力受到明显的遏制。Gan 等[27]的研究则表明，circRNA-MYLK 在OC 组织的表达明显高于癌旁组织。与circRNA-MYLK 低表达患者相比，circRNA-MYLK 高表达患者的病理分期更高，总生存率更低。沉默circRNA-MYLK，OC 细胞增殖能力明显减弱。这样的研究方式还有很多，但由于肿瘤的产生与发展都是多个因素影响和多环节调控的复杂过程，因此circRNA 具体的调节机理还需逐步明确。

上述研究表明，circRNA 在OC 组织与细胞系中存在表达差异。由于它具有共价闭合结构且不易被外切酶所消化，表达水平稳定。circRNA 可能在OC 的进展中产生重要影响，并发挥了癌基因和抑制癌基因的重要功能，circRNA 还能够作为分子标记辅助检测与治疗OC，为研究OC 发病过程和恶性发展提出了新的潜在靶点，对治疗包括癌症在内的许多慢性病具有着重大的意义。circRNA 作为miRNA 的ceRNA，在OC 的发生及恶性发展过程中扮演着关键调节作用。在癌症组织中，特异性表达的circRNA 可作为小分子诱饵吸附于miRNA 网络中。而miRNA可通过对靶基因表达的抑制而调整circRNA 的表达水平。而对circRNA 来说，其最主要的调节机制便是成为miRNA 的海绵，这样才能上调miRNA 家族以及下游靶基因的功能。而circRNA、miRNA 及其被控制的靶基因组，在OC 的调节中可能发生着相互协调、相互制约的关系。研究可以说明三者的相互关联，在癌症发生发展的相关分子机制中意义非凡，也丰富了癌症筛查、治疗的思路与方向。探索在OC 发生进展过程中的重要基因和调控通路，能提高OC 的早期治疗效果和改变治疗现状，进而改善OC 患者的生存率。研究circRNA 对OC 恶性生物活动的控制效果并阐述其机理，以期为OC 的防治提出全新的思想。

OC 是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，同时还是女性恶性肿瘤中死亡率最高疾病。早期诊断困难，且后期发展迅速。目前相关研究发现circRNA，如circRNA-UBAP2、circ-CELSR1、circ-TNPO 等均可能参与了OC 细胞增殖、侵袭、血管生成和淋巴管生成、自噬以及紫杉醇耐药等多种生物学过程[28-30]。在正常生理水平和病理状态下进行circRNA机制的研究，能够为广大医务工作者在肿瘤早期诊断和治疗中，提供新的思路和理论依据，为卵巢癌开发新的药物靶点，开拓新的方向，以提高OC 的早期治疗效果和改变治疗现状，进而改善OC 患者的生存率。但是，由于circRNA 数量众多，其具体的细胞学功能及在癌症发生和进展中详细的分子机制尚未完全清楚，特别是circRNA-miRNA-mRNA 构成了复杂的调控网络，有些下游靶基因的作用广泛。有关circRNAs 与OC 之间发生发展机制的研究，仍有相当多的问题有待探讨和发现，大部分circRNA 的功能仍未被研究。对circRNA 在各种疾病的进展中的生物学和分子机理还没有被充分认识。但是，随着现代生物工程技术和研究的进展，我们将识别更多的circRNA。circRNA 作为分子标记辅助检测与治疗OC，为研究OC 发病过程和恶性发展提出了新的潜在靶点，对治疗包括癌症在内的许多慢性病具有着重大的意义。