茯砖茶中冠突散囊菌的指标要求和检测方法分析

◎ 雷兰兰，舒 静，张 曼，冯海霞，刘源博

（陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048）

泾阳茯砖茶在2013年09月26日以独特的品质获得原国家质检总局“地理标志保护产品”称号[1]，泾阳茯砖茶也被誉为“中国古丝绸之路上的神秘之茶”[2]，距今已有600多年的历史，因其是在夏季伏天里加工制作，其香气和作用又和茯苓相似，且蒸煮压制后的外形呈砖状，所以称其为“茯砖茶”，属于再加工茶类中黑茶紧压茶的一种[3]。我国一千多种茶叶中，只有茯砖茶中生长繁殖有肉眼可见的金花菌，使得茯砖茶具有独特的发酵茶风味。

除了陕西泾阳，湖南益阳（安化）也是茯砖茶的产地之一。作为湖南特色产品的茯砖茶，是由安化的茶行采购原料黑毛茶运至陕西泾阳，委托当地茶坊压筑成茯砖茶[4]。无论是哪个产地的茯砖茶，其中均有大量不同种的微生物存在，但“金花菌”均是茯砖茶在加工筑制过程中产生的一种优势微生物。金花菌学名为“冠突散囊菌”，其子囊壳在茯砖茶茶叶中呈现肉眼可见的金黄色颗粒，俗称“金花”。研究表明冠突散囊菌以茶叶基质为营养成分生长，在生长代谢的过程中产生并分泌多种胞外酶，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等[5]。这些酶将茶叶中的纤维素、多糖、蛋白质等各种大分子物质转化、分解和降解成小分子物质，小分子活性物不但能够形成茯砖茶独特的风味品质，还使得泾阳茯砖茶具有调节血脂血糖、抗血栓、抗肿瘤和调理肠胃等方面的功效[6]。

1 茯砖茶产品标准中对冠突散囊菌指标的要求分析

我国现行有效的茯砖茶标准包括一个国家标准和两个地方标准，分别是国家标准《紧压茶 第3部分：茯砖茶》（GB/T 9833.3—2013）、陕西省地方标准《食品安全地方标准 泾阳茯茶》（DBS 61/0006—2021）和湖南省地方标准《安化黑茶 茯砖茶》（DB43/T 569—2010），三者对茯砖茶的定义和茯砖茶中冠突散囊菌限量值的规定如表1所示。这3个标准中规定的茯砖茶都是以黑毛茶为原料，主要的工艺过程均包括筛分、拼配、渥堆、定型、发花和干燥，最后包装。对于冠突散囊菌的指标，因为国家标准产品覆盖范围广，所以制定的冠突散囊菌指标要求最低，且未对产品质量等级进行分类，统一规定为20×104CFU·g-1。而泾阳茯砖茶因为属于地理标志保护产品，所以对冠突散囊菌的指标要求较高，且按照产品质量等级进行分类要求，对特一级的要求是35×104CFU·g-1，对特二级和一级的要求是30×104CFU·g-1。《安化黑茶 茯砖茶》中虽然将产品质量等级分类为超级茯砖茶、特制茯砖茶和普通茯砖茶，但是对冠突散囊菌的指标要求统一为30×104CFU·g-1，且注明该指标为参考指标，所以不用于产品合格与否的判定。因此综合来看，陕西省地方标准《食品安全地方标准 泾阳茯茶》（DBS 61/0006—2021）对冠突散囊菌的指标要求最为严格。

表1 茯砖茶标准中冠突散囊菌的指标要求表

2 茯砖茶标准中冠突散囊菌的检验方法分析

目前对茯砖茶中冠突散囊菌数量的检测，3个标准规定的检验方法都是《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）中的第一法平板计数法。相较于涂布接种，该方法使用倾注接种的菌落是在培养基内部生长，不便于挑取菌落进行后续实验。把握不好倾注融化的热琼脂温度，可能会影响部分有损伤的待检菌的生长，但倾注法的接种量是涂布接种法的10倍，因为加样量比较大，所以加样误差比较小。稀释液为无菌蒸馏水、无菌生理盐水或者无菌磷酸盐缓冲液，无菌蒸馏水使用简单方便，仅需灭菌分装即可使用，不需要额外的试剂；生理盐水和磷酸盐缓冲液对生物细胞有更好的保护作用[7]，生理盐水可以给微生物细胞一个相对稳定的渗透压，能够防止细胞因渗透压改变而破裂或脱水死亡；磷酸盐具有较强的缓冲能力，可以为细胞维持一个较为稳定的pH环境，避免细胞受损害。但是生理盐水的配制方法更简单，试剂成本也更低。刘凯利等[8]通过响应面试验，研究了无菌水、不同浓度的氯化钠稀释液和磷酸盐缓冲液对茯砖茶中金花菌菌落总数的影响，发现当稀释液为无菌生理盐水时，金花菌的菌落总数计数最多。具体的操作步骤是称取25 g固体样品，加入225 mL无菌稀释液，进行充分地振摇或拍打，制成10倍稀释的样品匀液，再继续进行梯度稀释。同时在进行梯度稀释的过程中，选取2～3个稀释度，每个稀释度分别取1 mL的样品稀释液加入两个无菌培养皿内。接着将冷却至46 ℃的培养基约25 mL倾注于培养皿中，转动培养皿使其混匀，置水平桌面待培养基完全凝固。琼脂凝固后，将平板正置于（28±1）℃的培养箱中培养并观察。培养至第5天时记录结果，选取菌落数在10～150 CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母[9]。从该过程可以看出，GB 4789.15—2016第一法平板计数法是霉菌和酵母菌的非选择性计数检验方法，是否适用于茯砖茶中冠突散囊菌的计数检测还有待于验证。

3 茯砖茶取样方式的讨论

GB 4789.15—2016第一法中规定，对于固体样品，称取25 g用于制备10倍稀释的样品匀液。由于茯砖茶中的冠突散囊菌一般位于茶砖的中间部位，距离茶砖表面1 cm范围内几乎无肉眼可见金花，而茶砖因为经过压制工艺，内部的金花也存在分布不均匀的现象，因此取样方式的不同也会造成冠突散囊菌检测结果有很大差异。目前常见的取样方式为粉碎法和五点取样法。粉碎法即为使用粉碎机将茶砖整体粉碎过筛后称取25 g茶样进行检测。五点取样法是指在茶砖对角线上距离茯砖茶四角1～3 cm处的4个点和茶砖中心点取样，每个点取样5 g左右。刘凯利等[8]、马跃等[10]研究发现，使用粉碎法对茯砖茶中冠突散囊菌进行计数检测，得到的茯砖茶中冠突散囊菌的数量为106CFU·g-1，远远超过国家标准法的 105CFU·g-1，且粉碎法得到的数据整体稳定性较高。但本实验室在使用粉碎法时发现，茶砖被粉碎后形成细小的茶粉，在检测取样时，细小的茶粉很容易漂浮到空气中，造成实验室的环境污染，所以该方法不适合批量检测。相比粉碎法，五点法操作简单，不需要粉碎机，仅使用微生物检测实验室常用的无菌取样工具即可进行取样，但是由于金花分布的不均匀性，五点法取样不能够代表茶砖中冠突散囊菌的真实数量。因此，检测冠突散囊菌时，对茯砖茶的取样方式还需要进行研究。

4 3种培养基上冠突散囊菌的生长状况

除了GB 4789.15—2016中规定的两种培养基（孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂），再增加察氏琼脂培养基，按照GB 4789.15—2016的检验步骤进行操作，其中稀释液使用无菌生理盐水，对茯砖茶中冠突散囊菌进行计数检验。培养至第5天时，结果如图1所示。

图1 3种培养基上冠突散囊菌的生长状况图

孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂上的冠突散囊菌菌落形态致密，呈绒毛状，边缘呈清晰可见的圆形，且在孟加拉红琼脂上是非常典型的金黄色，与培养基本身的红色基质形成明显的对比。而在察氏培养基上的冠突散囊菌菌落疏松，颜色暗淡，与培养基对比不够清晰，难以计数。因此综合考虑，孟加拉红琼脂为检验茯砖茶中冠突散囊菌的最适培养基，这也与刘相真等[11]的研究结论一致。

5 结论

虽然茯砖茶的不同产品标准中对冠突散囊菌的指标要求不同，但冠突散囊菌是评价茯砖茶质量优劣的关键指标，其检测方法却存在问题和争议。本文分析了冠突散囊菌检测时不同取样方式的优缺点，描述了冠突散囊菌在3种不同培养基上的菌落形态特征，为茯砖茶中冠突散囊菌的检验检测提供一定的理论基础和实践依据。