异常原料乳中一株短小芽孢杆菌的分离与鉴定

刘祥杰，张家浩，邢潇月，李虎，李莲瑞*

（1.塔里木大学动物科学学院 新疆阿拉尔 843300；2.塔里木畜牧科技兵团重点实验室 新疆阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室 新疆阿拉尔 843300）

原料乳是从泌乳牛体内挤出的未经任何加工如纯白丝绸般的乳液，奶味醇香，润如滑脂，也称为“生鲜乳”或“原奶”。随着改革开放的脚步，牛乳成为了家家户户所必需的营养品。牛乳不再是只有少数的富人才能拥有的奢侈品，它早已转变为“飞入寻常百姓家”的产品。随着牛乳需求的增加，全国各地的乳品企业纷纷兴起。牛乳已经不单单只是拿来饮用，各种乳制品也应运而生。酸奶、奶酪、奶粉等已屡见不鲜。然而，牛乳的卫生问题却令人堪忧。微生物含量过高会导致原料乳快速腐败变质，微生物的种类不仅影响原料乳及乳制品的品质，还可造成疾病暴发。

短小芽孢杆菌（bacillus pumilus）是一种短杆状，能运动，兼性营养，革兰氏阳性菌，同属芽孢杆菌科属[1,2]。牛乳在加工的过程中，必须要经过高温消毒灭菌，但也不能杀灭所有的细菌，也会有一些耐热菌残留，短小芽孢杆菌就是一种常见的耐热菌，要在高温（55℃）下才能培养出来。本研究通过对异常原料乳分离培养测序后，分离的菌株为短小芽孢杆菌。为今后原料乳的卫生问题提供有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品：原料乳，由阿拉尔乳业公司提供，取自原料乳储存罐，机械随机取样。取回后4℃存放，以备后面分离短小芽孢杆菌。

1.2 试剂与仪器

实验试剂：95%乙醇溶液、结晶紫溶液、碘液、0.5%番红乙醇溶液、锰盐营养琼脂、普通营养琼脂、嗜冷菌计数琼脂。

实验仪器：见表1。

表1 实验仪器清单

1.2 实验方法

1）菌株的筛选、分离、纯化。在洁净工作台里，在无菌锥形瓶中加入100mL 乳样，置于80℃水浴20min 后，倍比稀释5 个梯度后用涂布法分别接种于锰盐（55℃）、普通（37℃）营养琼脂培养基倒置培养24～48h，嗜冷菌计数培养基（5℃）倒置培养5～7d，对菌落进行形态观察，选取不同的菌落，在平板上划线培养。载玻片上加10μ L 无菌水，挑取纯化的单菌落均匀涂布，自然晾干或酒精灯外焰烘干固定，进行革兰染色镜检。选取镜检有芽孢的单菌落，接种到细菌瓶中置于摇床过夜培养，增加菌体浓度。将分离的菌液与50%甘油溶液按1:1 比例混合均匀，冻存于-20℃和-80℃。

2）异常原料乳中短小芽孢杆菌DNA 的提取。无菌离心管中加菌液1mL，高速离心60s，弃上清，重复1 次，收集适量菌体沉淀。然后开始提取菌体DNA，提取完成后冻存于-20℃备用。

3）异常原料乳中短小芽孢杆菌16s rRNA 扩增。菌体DNA 提取按照DNA 提取试剂盒说明书进行。采用细菌的通用引物16s 进行PCR 扩增，反应条件如下：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和 1492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'；DNA模板1μ L，EasyTaq SuperMix12.5μ L，上、下游引物各0.5μ L，ddH2O 10.5μ L；94℃预变性 5min；94℃变性 30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，72℃再延伸10 min，35 个循环。PCR 结束后，将产物置于1%琼脂糖凝胶电泳，电泳到达第四小格观察是否有目的条带并拍照保存。

PCR 结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳到达第四小格观察是否有目的条带并拍照保存。

4）短小芽孢杆菌16s rRNA 克隆与pMD-19T 载体自连克隆。

5）PCR 产物切胶回收。参照北京全式金生物技术有限公司胶回收试剂盒（L41118）说明书进行切胶回收，回收产物保存于-20℃备用。

6）目的基因和pMD-19T 载体连接。该菌16s rRNA 的基因序列与pMD-19T 连接后转化DH5α，提取质粒送测序。

7）提取质粒。质粒提取根据质粒小提试剂盒说明书进行，质粒DNA 保存备用。质粒DNA 用通用引物进行扩增，在1%琼脂糖电泳后，观察条带大小。

8）测序。选取鉴定后的阳性质粒DNA 送测序。

1.3 菌株16s rRNA 同源性及进化树分析

将序列在NCBI 上进行BLAST 比对分析，选取同源序列，构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

该菌的菌落呈小而圆的淡黄色有光泽半透明隆突。革兰氏染色，为两极浓染，菌体中间有折光芽孢的革兰氏阳性菌[1,2]，初步鉴定疑似短小芽孢杆菌，镜检结果显示见图1。

图1 革兰染色镜检结果图（10× 100）

2.2 16s rRNA 的鉴定结果

1）16s rRNA 的扩增结果如图2。

图2 16s rRNA 的扩增结果

2）16s rRNA 质粒的鉴定结果如图3。

图3 16s rRNA 质粒的鉴定结果

3）异常原料乳中短小芽胞杆菌的16s rRNA 的测序结果。

细菌lxj 的序列如下：

GTTtCGGCTgTCACTTACAGAWGGACCGCGgCSCATtAGCT AGTtGGTGGGgTAaTGKcTCaCCAaGGcGRCGaTGSGTAGCSGAc CTGAGAGGGTGATCGgCCACAcTGGgACTGAGACaCggCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGgAaTCTtCcGCAaTGgACGA AAGTCtGACGgAGCaACGCCGCGTGAGKGATGAaGgTTTTCgGA TCGTAAAGCTCTGTtGTTAGGGAaGAaCAaGTGCGAGAGTaACT GCTCGCACCTtGACGGTACCTAaCCAGAAAGcCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGT CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA GTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTG GAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTC CACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC AGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGA GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCC GCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCA ACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCC TAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGgTGGT GCATGRtTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTtGGGTtAAGTC CCGCAaCGAGCGCAaCCCTtGATCTtAGTtGCCAGCATTtAGTtG GGCACTCTaAGGTGACTGCCGgTGACAAACCGgAGgAaGGTgG GGATGACGTCAAaTCATCATGCCccTTATGACcTGGGCTACaCA CGTGCTACAATGRASAgAACAAAGGgCTcGCGAGAMCGcAaGg TTtAGCCAaTCCcATAAaTCTGTTCcTCAGTTCGgAT

4）16s rRNA 基因同源性与遗传进化树分析。测序结果比对后，构建了基因系统进化树（图4，图5）。结果表明，该菌株与登录号为ON287144、ON287180、MT704414、OM341623、OM346695、OM6583 69、ON165743、OM617828 的短小芽胞杆菌处于同一分支，且根据同源性分析，该菌株与短小芽孢杆菌的同源性为99%，综上所述，确定为短小芽孢杆菌。

图4 系统进化树

图5 同源性分析

3 讨论

短小芽孢杆菌对乳品能够产生不小的危害，社会上却很少有关于短小芽孢杆菌能引起食物中毒的报道，可能是短小芽孢杆菌污染食品的机率小[3]，也可能是乳品企业的管理工作做得好。造成乳品污染的原因有很多种，可能是乳品生产环境中微生物，加工车间和加工生产设备[4]；也可能是原料乳的源头出现问题，奶牛的生活环境、接触生奶的用具、管道、工作人员的疏忽[5]、挤奶时没有清洗牛乳房并弃去头三把奶[6]等，这些都是不容忽视的关键。

本实验通过对原料乳储存罐中的奶样进行一系列检测分析，发现原料乳中存在许多微生物，菌种繁多，非常丰富，不单单只是有害菌，还有一些有益菌。中国作为一个人口大国，对牛乳的需求也越来越多，乳品企业不能为了效益，而盲目的忽略食品安全。甚至一些黑心企业为了追求销量，在牛乳中掺水，掺食盐，掺一些非法添加剂，这不仅严重损害了人体健康，还欺骗了广大消费者。乳品安全问题一直存在，可能存在原料乳中，也可能存在生产加工环节。只有加大宣传力度，重视乳品质量，从最开始的源头抓起，在挤奶时，在贮存运输时，在饲养管理中，在收乳、生产和检验全过程中，重视每一个过程，严把质量关，严格做到没有检测合格的乳样禁止进入市场。宁肯销量少，也不质量差。只有这样，才能让广大消费者喝到健康、安全的牛乳。