曼氏裂头蚴6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达及转录水平分析

郝润莲，刘锦腾，王大勇，林于今，王妹妹，左世亮，王亚妹，梁 培，

曼氏迭宫绦虫(Spirometramansoni)是一种人兽共患的寄生虫，其需要多个宿主才能完成一个完整的生活史，终宿主为猫、犬科动物，第一中间宿主为剑水蚤；第二中间宿主为蛙类，然而蛇、鸟、猪等多种脊椎动物，亦可做其转续宿主。人可以做为该虫的第二中间宿主、转续宿主甚至终宿主[1]。其幼虫-裂头蚴(sparganum)可寄生于人体，引起严重的曼氏裂头蚴病。由于裂头蚴寄生于人体各个组织器官，较多见于脑部、眼部和皮下组织。裂头蚴寄生于脑部能够引起脑部功能障碍，甚至瘫痪或死亡；裂头蚴寄生于眼部，可导致失明。据流行病学调查发现，曼氏裂头蚴病呈全球性分布，但在东亚和东南亚地区报道的病例较多[2]。据不完全统计，目前我国已有数千例曼氏裂头蚴病病例报道[3]，由于临床诊断方法受限，存在一定数量的漏诊或误诊病例，而未得到真实统计报道。近5年，我国的广东、吉林、湖南、福建、海南、四川、上海、云南、河南、江苏等常有病例报道，其中广东报道的病例数位居榜首[4]。人主要通过下列两个途径感染裂头蚴：1)主要通过饮用生水误食剑水蚤或食用生的、半生的青蛙肉或是蛇肉感染裂头蚴；2)有使用青蛙肉或是蛇肉敷贴创伤口进而感染裂头蚴[5]。

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGDH)是磷酸戊糖途径中的关键酶之一，参与磷酸戊糖途径的第3步反应，其主要生理功能是通过调节核糖-5-磷酸(R-5-P)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的生成，在核苷酸和脂质的生物合成以及维持氧化还原的动态平衡中起着至关重要的作用[6-7]。该酶存在于众多生物体中，包括细菌、真菌、植物和动物中都存在[8]，参与生物体内递氢体NADPH的产生[9-10]。该酶产生的NADPH主要参与氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成。有研究通过对家蚕微孢子虫中的6PGDH进行的生物信息学分析，发现该分子参与了微孢子虫的增殖发育过程[11]。

曼氏裂头蚴寄生于中间宿主体内，青蛙的肌肉中、人体脑部、人体眼部和皮下等，虫体维持自身的生存必须从宿主细胞中获得大量的营养物质。目前，国内外对于裂头蚴的糖代谢研究甚少，对其能量供应和与宿主之间的营养物质交换的研究更是缺乏。本项目从裂头蚴中提取总RNA逆转录成cDNA作为模板，从成虫基因文库中调取Sm6PGDH的全长基因序列进行生物信息学分析，并对Sm6PGDH进行基因的克隆和蛋白的原核表达，及其在不同浓度葡萄糖培养裂头蚴后的转录水平，为今后研究其生物学功能，尤其作为潜在价值的药物研究靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 序列和菌种 由海南医学院基础医学院病原生物学教研室吕刚教授课题组提供Sm6PGDH全长基因序列。中山大学寄生虫学教研室赠予含有两个His标签的原核表达质粒载体pET-28a(+)。从天根生化科技(北京)有限公司购得大肠埃希菌菌株E.coliDH5α及BL21(DE3)。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨 (Tryptone)、酵母提取物 (Yeast extract)、Trise-Base购自英国OXOID公司；预染蛋白Marker (protein Marker)、T4-DNA ligase、限制性核酸内切酶BamH I、内切酶Hind Ш、逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；SYBR Premix Ex TaqTMII购自宝日医生物技术(北京)有限公司。蛋白表达的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自美国Sigma公司；DNA Marker(DL2000，DL1500)、TaqDNA聚合酶、Gold View核酸染料购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；氯化钠、咪唑、脱脂奶粉等化学试剂购自北京Sloarbio公司；单克隆抗His标签小鼠抗和抗小鼠IgG-HRP抗体购自美国Proteintech Group公司。

1.2 方 法

1.2.1Sm6PGDH全长基因的识别 从曼氏迭宫绦虫成虫基因组文库中调取Sm6PGDH的全长序列，利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的ORF Finder在线软件预测分析该基因的开放阅读框(ORF)。通过NCBI网站中的BLASTx程序，将Sm6PGDH核苷酸序列与Gene Bank中的核苷酸序列进行同源性的比对分析。

1.2.2Sm6PGDH的生物信息学分析 利用在线的蛋白质分析系统ExPASy(www.expasy.org/)中的ProtParam分析工具预测分析Sm6PGDH的理化性质，如氨基酸的组成、分子量、等电点等性质；利用在线SignalP和SecretomeP-2.0工具分析Sm6PGDH序列中可能存在的分泌信号肽或是否属于通过非经典途径分泌的蛋白分子；利用在线DictyOGlyc、NetPhos、NetAcet工具：分别预测Sm6PGDH氨基酸序列中是否存在潜在的o-(α)-GlcNAc糖基化位点、磷酸化位点、N端乙酰化位点。利用Predictprotein在线工具分析Sm6PGDH的二级结构和亲水性特征；通过B细胞线性表位在线分析软件(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)分析Sm6PGDH中潜在的B细胞线性表位。

1.2.3Sm6PGDH基因的扩增

1.2.3.1 引物设计与合成 根据从Sm6PGDH全长基因序列进行特异性引物的设计并由上海生工生物工程有限公司负责合成。上游引物：5′-AAGGATCCATGTCAGGCCGAGGGAAT-3′(下划线部分为BamHⅠ的酶切位点)；下游引物：5′-CGAAGCTTGGTAGTATTTCCGCCGTC-3′(下划线部分为Hind Ш的酶切位点)。

1.2.3.2Sm6PGDH基因的扩增及产物的纯化回收 从野生青蛙肌肉中分离裂头蚴，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，再利用逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，利用上述特异性引物进行扩增Sm6PGDH全长基因序列。PCR反应体系(50 μL)：cDNA模板2.0 μL、上游引物2.0 μL、下游引物2.0 μL、PCR Mix(Taq聚合酶混合物)25.0 μL、去离子水(ddH2O)19.0 μL。将上述混合物混匀后，在以下反应条件下进行扩增：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 45 s、退火53 ℃ 55 s、延伸72 ℃ 60 s，一共35个循环；72 ℃再延伸10 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定，再利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收PCR产物(按照回收试剂盒的说明操作)。

1.2.4Sm6PGDH基因的原核克隆 用限制性核酸内切酶BamH I和Hind Ш对回收的PCR产物和原核表达载体pET-28α(+)分别进行双酶切。反应体系(20 μL)：原核表达载体或纯化回收PCR扩增产物6 μL、10×Buffer 2 μL、BamH I 1 μL、Hind Ш 1 μL、ddH2O 10 μL，在37 ℃条件下反应1 h。对酶切后的PCR产物与载体pET-28a(+)进行琼脂糖凝胶电泳，并利用DNA纯化试剂盒纯化回收酶切产物。连接反应体系(20 μL)：纯化回收PCR双酶切产物2 μL、纯化回收载体双酶切产物6 μL、Ligase Buffer 2 μL、T4 DNA ligase 1 μL、ddH2O 9 μL，室温反应2 h得到连接产物。将上述的连接产物20 μL加入E.coilDH5α感受态细胞中，利用热休克法进行转化，将菌种铺于含有0.1%卡那霉素的LB固体培养基中，置于37 ℃培养箱中培养过夜，次日挑取阳性克隆菌株，送菌液样本至上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。

1.2.5 重组蛋白的原核表达和纯化 根据测序结果将正确克隆的重组质粒pET-28a(+)-Sm6PGDH转化到表达菌株E.coliBL21(DE3)中。利用1 mmol/L IPTG分别在28 ℃、37 ℃条件下进行小量诱导，在诱导0、2、4、5 h取样1 mL，12 000 r/min离心，取沉淀进行12%SDS-PAGE电泳分析，空载体pET-28a(+)为空白对照组。将上述得到的最佳的诱导条件进行蛋白的大量诱导，获得菌液进行离心收集菌体，加入5%咪唑混匀后，进行超声破碎，12 000 r/min离心10 min，收集上清，利用镍离子亲和层析柱进行蛋白纯化，得到的蛋白进行12% SDS-PAGE电泳分析。

1.2.6 Western blot鉴定 将纯化蛋白进行12% SDS-PAGE电泳后，将电泳凝胶浸泡于转移液中5 min，PVDF膜依次浸泡于100%甲醇15 s和ddH2O 5 min。在冰水混合物中，100 V恒压的条件下进行电泳转膜1 h，用5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，次日用PBST溶液振荡洗涤，每次5 min，洗涤5次。加入1∶15 000稀释的抗-His小鼠单抗(1% BSA-PBS作为稀释液)，室温下孵育2 h，PBST漂洗5次，每次5 min；然后加入抗小鼠IgG-HRP抗体(1∶5 000，1% BSA-PBS稀释)，室温孵育2 h，PBST漂洗5次，每次5 min；在黑暗环境下，利用ECL化学发光法显色，观察记录并保存结果。

1.2.7 不同浓度葡萄糖培养裂头蚴的转录水平分析 从野生青蛙中分离出裂头蚴分别利用无糖、低糖(1.0 g/L)、高糖(4.5 g/L)培养裂头蚴，加入10% FBS和双抗进行体外培养24 h后，收集虫体，利用RNA提取试剂盒进行总RNA提取，利用逆转录试剂盒合成cDNA，反应体系为(20 μL)：2 μL cDNA模板、正向和反向引物各0.2 μL、PCR Mix 10 μL、去离子水补足。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40个循环。Sm6PGDH引物：5′-TGAAGCCTACCATCTTCTCCG-3′、 5′-GACAG-CCTCGTTCCAGACCAC-3′。内参基因Actin引物：5′-CATCTACGAGGGTTACGCACTG-3′、 5′-GCTCATCTCCTGCTCAAAGTCC-3′。

2 结 果

2.1Sm6PGDH基因的核苷酸序列特征Sm6PGDH全长序列中最长的开放阅读框为1 476 bp，共含有491个氨基酸编码。根据NCBI数据库分析，发现Sm6PGDH基因序列与增殖型裂头蚴的同源核苷酸序列(Sparganumproliferum，VZI12751.1)一致性为93.15%，与细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus，KAH9286725.1)和多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，CDS40863.1)的同源核苷酸序列一致性在75%以上，与人的同源核苷酸序列(Homosapiens，No.P52209)一致性为66.3%，与小鼠的同源核苷酸序列(Musmusculus, No.Q9DCD0)一致性为65.9%。Sm6PGDH属于NADP(+)依赖性脱羧磷酸葡萄糖酸脱氢酶，有完整的Gnd结构域，是Gnd超基因家族的成员。

2.2Sm6PGDH的生物信息学预测分析Sm6PGDH的等电点为6.68，理论相对分子量约为53.84 kDa，略偏酸性。由C、H、O、N、S 共5种原子共同组成。其中，含量前列的氨基酸为甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)，其含量分别为10.8%、9.8%、7.3%、7.1%。Sm6PGDH氨基酸序列分析中未发现含有信号肽，并且非经典途径分泌软件预测得到数值较低，则其应是一个胞内蛋白分子。Sm6PGDH二级结构分析得出该分子主要以α螺旋(H)为主，其占比为49.29%，β折叠(E)和无规则卷曲(O)的占比分别为11.00%、39.71%。此外，该蛋白的氨基酸序列中共有29.53%的可溶性的氨基酸残基暴露在溶液界面中，含有59.67%的氨基酸其残基嵌于蛋白内部。

2.3Sm6PGDH糖基化位点、磷酸化位点和乙酰化位点预测分析 利用DictyOGlyc-1.1分析工具预测Sm6PGDH蛋白质在Ser143位点存在一个O-糖基化(见图1，A)。Net Phos分析显示，编码的氨基酸序列中存在潜在的磷酸化位点共39个，22个丝氨酸(Ser)磷酸化位点、12个苏氨酸(Thr)磷酸化位点、5个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(见图1，B)。利用NetAcet分析工具预测Sm6PGDH的N末端不存在乙酰化位点。

图1 Sm6PGDH氨基酸序列中o-GlcNAc糖基化位点和磷酸化位点预测Fig.1 O-glycosylation site and phosphorylation site prediction for Sm6PGDH

2.4Sm6PGDH的B细胞表位 通过B细胞线性表位分析软件预测，Sm6PGDH的氨基酸序列中可能存在9个潜在有效的B细胞表位(表1)。

表1 Sm6PGDH的B细胞表位Tab.1 B cell epitopes of Sm6PGDH

2.5Sm6PGDH基因的全长扩增和重组表达质粒的构建 利用特异性引物进行扩增得到全长序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示分子量在1 500 bp左右的位置出现特异性条带(见图2A)；将全长序列克隆到原核表达中，重组质粒双酶切鉴定显示2个条带，分别在1 500 bp和5 400 bp在位置(图2B，第4泳道)。

A：Sm6PGDH基因的全长序列，第1泳道是Sm6PGDH扩增产物电泳条带；M是DNA Marker DL2000。B：重组质粒pET-28a(+)-Sm6PGDH的双酶切鉴定。M1：DNA Marker DL2000；1：全长基因PCR产物；2：pET-28a(+)载体；3重组质粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；4：重组质粒pET-28a(+)-Sm6PGDH双酶切所得产物(分别在1 500 bp位置和5 400 bp位置)；M2：DNA Marker DL1500。图2 Sm6PGDH基因的全长扩增和重组表达质粒的鉴定Fig.2 PCR analysis of Sm6PGDH and identification of the recombinant plasmid

2.6 重组蛋白诱导表达及鉴定 含有重组质粒的大肠埃希菌分别在28 ℃和37 ℃下诱导不同的时间，通过图3发现，在37 ℃下诱导4 h蛋白的表达量最高，利用亲和层析柱得到分子量55 kDa的目的蛋白。利用His抗体进行纯化蛋白鉴定，在目的分子量位置得到目的条带。

A.1:未经诱导的pET-28a(+)空载体；2：经IPTG诱导的pET-28a(+)空载体；3：未经诱导的重组质粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；4、5：在28 ℃下诱导2 h和4 h的重组质粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；6、7、8：在37 ℃下诱导2 h、4 h、5 h的重组质粒pET-28a(+)-Sm6PGDH；M:Protein Marker。B.M:Protein Marker; 1、2、3：Sm6PGDH纯化蛋白；C.Sm6PGDH纯化蛋白的His抗体鉴定。图3 Sm6PGDH重组蛋白的诱导表达和鉴定 Fig.3 Expression and identification of recombinant Sm6PGDH

2.7 不同浓度葡萄糖培养裂头蚴的转录水平差异

Sm6PGDH在不同浓度葡萄糖培养裂头蚴体内的转录水平存在差异，与正常组裂头蚴相比较，在无糖组、低糖组和高糖组分别高出3倍、5倍和5.3倍，见图4。

图4 Sm6PGDH在不同浓度葡萄糖培养裂头蚴中转录水平分析Fig.4 Transcriptional levels of Sm6PGDH in sparganum exposed to different concentrations of glucose

3 讨 论

戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway，PPP)是生物体糖代谢的重要途径之一，是生物合成NADPH的主要来源。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是磷酸戊糖途径的关键限速酶之一，它催化6-磷酸葡萄糖酸氧化脱羧转化形成5-磷酸核酮糖，伴随着NADPH的合成[12]。NADPH主要参与合成代谢，如氨基酸、脂类及核苷酸等细胞组成物质的合成都需要NADPH，对细胞正常生长和代谢有重要的影响。5-磷酸核酮糖参与核酸的合成，为其合成提供戊糖[13]。因此，6PGDH在生物的生长发育过程中起着至关重要的作用。

目前，对6PGDH的研究主要集中在原核生物、植物以及真菌，而该酶在寄生虫中的研究较少，对于曼氏裂头蚴的6PGDH研究尚属空白。对于寄生虫而言，磷酸戊糖途径中关键酶是必不可少的，这些酶与它们所寄生哺乳动物中的同源性酶在结构上有所差异，因此，可以作为抗寄生虫药物的靶点[14]。

通过NCBI数据库分析显示Sm6PGDH是一个NADP(+)依赖性脱羧磷酸葡萄糖酸脱氢酶，是Gnd超基因家族的成员。Sm6PGDH与其他绦虫同源基因的核苷酸序列一致性较高，与人的同源核苷酸序列一致性达60%以上，为此，该酶在物种进化上较为保守。Sm6PGDH的氨基酸序列中不具有信号肽也不能通过非经典途径分泌，是一个疏水性的胞内蛋白分子。在不同浓度葡萄糖培养裂头蚴中Sm6PGDH的转录水平都比正常组高，在低糖组和高糖组中的转录水平不存在差异，该酶在寄生虫适应外界环境中发挥一定的调节作用，其作为一个糖代谢途径的酶分子，在细胞质中调节细胞的能量代谢和合成NADPH用于其他生物成分合成。

在蛋白质的二级结构中，α螺旋和β折叠在维持蛋白质的稳定性上发挥重要作用，而无规则卷曲所形成的二级结构比较松散更容易发生变形，这更有利于形成酶活性部位和特异的功能部位，更有利于与底物、配体或是抗体相结合，而发挥生物学功能[15-17]。本文通过Predictprotein预测Sm6PGDH二级结构中以α螺旋为主，无规则卷曲的占比为39.71%，说明该蛋白整体结构较为稳定，无规则卷曲占比高这一特征可能更有利于生物学功能的发挥。免疫特性预测分析发现该蛋白含有9个有效的B细胞线性表位，这提示寄生虫可以通过这些表位介导虫体的体液免疫，并且可能有效地调节特异性抗体的类型，提高抗体的免疫杀伤能力。在Sm6PGDH序列分析中，我们还发现在Ser143存在1个O-糖基化位点，有研究发现糖基化位点可能更有利于病原体识别和免疫响应[18-19]。此外，该蛋白分子的序列中还存在潜在的39个磷酸化位点，蛋白在磷酸化作用后，蛋白质便具有了电荷，从而使整个分子结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化[20-22]。此外，本研究通过原核表达该蛋白，从上清液中分离纯化到水溶性的蛋白分子，并利用底物开展了酶学活性的研究，但发现得到的上清纯化蛋白分子并未表现出活性，其原因可能是该蛋白的氨基酸序列中含有糖基化位点和多个磷酸化位点，在原核表达系统中，不具有糖基化和磷酸化的修饰，为此本研究得到的纯化蛋白不具有活性。若开展该蛋白在活性功能方面研究，则需要利用真核表达获得修饰后的蛋白才具有活性。

综上所述，Sm6PGDH在同源序列比对中，与其他绦虫的同源性较高，且具有较多的免疫表位，提示可以进一步探究该分子是否可作为开发广谱抗寄生的疫苗分子。此外，Sm6PGDH是磷酸戊糖途径的关键酶分子，本研究得到的Sm6PGDH蛋白可以为在裂头蚴的糖代谢的规律研究中提供了物质保障。

利益冲突：无

引用本文格式：郝润莲，刘锦腾，林于今，等. 曼氏裂头蚴6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因克隆、蛋白表达及转录水平分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：963-969. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.142