芯片法筛选钩端螺旋体外膜蛋白抗原表位

胡玮琳, 夏文浩, 任雨轩

钩端螺旋体病是一种全球流行的自然疫源性人兽共患病，也是我国重点监控并列入计划免疫项目的传染病[1]。接种疫苗是预防传染病最有效的措施之一。目前钩体疫苗产品为多价全菌灭活苗，其对菌苗未包含的血清群感染无明显的保护作用。最近我国部分地区出现了菌群更迭感染引起的钩体病流行[2-5]。因此，研制对不同血清群有交叉保护作用的通用性新疫苗，对于该疾病的防控具有极为重要的意义。

外膜蛋白是革兰阴性菌主要表面抗原，也是亚单位疫苗研发的对象。国内外研究显示，重组问号钩体Lig、LipL32、Loa22等外膜蛋白具有良好的免疫原性和保护性[6-10]。目前普遍使用工程菌串联表达多种外膜蛋白，该方法获得的大分子融合蛋白表达量低下是制约重组蛋白亚单位疫苗研发的瓶颈，而表位是抗原蛋白中负责引发免疫应答的小分子肽片段，其中优势表位代表或决定抗原蛋白主要免疫原性。因此，表位疫苗是近年基因工程疫苗研制热点，具有能同时提呈多个表位、抗原提呈作用强、分子量小、免疫效果好等优点。本研究采用生物信息学结合表位芯片技术筛选问号钩体主要抗原蛋白中的优势表位，为研制有广泛交叉保护作用的疫苗提供基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养 钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株、爪哇群爪哇型56602株、秋季群秋季型56606株、澳洲群澳洲型56607株、波摩那群波摩那型56608株、流感伤寒群临型56609株、七日热群七日热型56610株以及曼耗群清水型56615株保存于本实验室，采用EMJH液体培养基28 ℃培养上述钩体株[11]。

1.2 外膜蛋白基因扩增 采用细菌基因组提取试剂盒(Axygen)提取上述钩体基因组DNA，使用Nanodrop测定其浓度和纯度。采用PCR扩增ligB、loa22、lipL32基因，引物(表1)由杭州擎科生物有限公司进行合成。PCR总体积50 μL，采用Phanta○RUc Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(Vazyme)，内含0.2 mmol/L dNTP Mix、0.4 μmol/L各上下游引物、1U Phanta高保真酶、100 ng DNA模板、1×Uc缓冲液。PCR参数：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 5 min。采用TS-GelRed核酸凝胶染料(Tsingke)预染的1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。使用PCR产物纯化试剂盒(Axygen)纯化上述片段，委托杭州擎科生物有限公司测序。

表1 钩体基因PCR检测引物序列Tab.1 Primer sused for leptospiral gene detection by PCR

1.3 主要外膜蛋白中抗原表位预测 分别采用抗原表位预测软件SYFPEITHI epitope prediction(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)、EMBOSS antigenic(http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/antigenic)预测T细胞和B细胞表位[12-13]。打开SYFPEITHI软件后选择MHC II类(15 aa)，综合各HLA-DRB1亚型打分排序，选取分值≥25的预测T细胞表位序列进行后续分析；打开EMBOSS antigenic软件，设置抗原区aa≥6，对B细胞表位进行打分排序，选取分值≥1的序列作进一步分析。氨基酸序列同时含有T细胞和B细胞表位，且长度不大于30 aa判定为T-B联合表位。

1.4 全菌抗血清及IgG制备 大鼠抗钩体56601、56606、56607、56608、56609、56610、56602、56615株全菌血清由本实验室提供。采用抗体纯化磁珠(Beaver BeadsTMProtein A/G，海狸生物)分离血清中IgG。

1.5 芯片法检测抗原表位免疫反应性 抗原表位肽委托上海吉尔生化(GL Biochem)有限公司合成，HPLC纯度95%。表位肽定制芯片委托上海卓立生物科技有限公司制备并测试。具体测试步骤如下：将制备好的芯片固定于芯片杂交架，使用含有5%脱脂奶粉的PBST室温封闭芯片1 h。使用0.5% PBST清洗2次后使用PBS清洗。取1∶100稀释后各抗血清IgG一抗加入到相应孔中，室温孵育2 h。按上述方法清洗芯片后，使用Biotin标记山羊抗大鼠1∶2 500稀释二抗加入到杂交孔中，室温孵育2 h后，同样使用上述方法清洗芯片。取稀释后SA-cy5加入到杂交孔中，室温水平摇床孵育20 min。使用0.5% PBST清洗芯片2次后，PBS清洗1次，去离子水清洗1次，干燥后扫描读数。计算各芯片位点发光强度信噪比(Signal to noise ratio, SNR)，即SNR=(信号强度-背景强度)/背景强度，当SNR≥2视为阳性。同时，实验中设置BSA点制孔以及健康大鼠血清IgG组作为阴性对照。在筛选芯片上阳性信号点时，结合该位点的信号强度、重复性与信噪比综合考虑。

2 结 果

2.1 基因扩增及测序结果 本文所列致病性钩体基因组中均可检出ligB、loa22、lipL32基因片段(图1)。序列分析结果显示，与我国最为流行的黄疸出血群赖型56601株相比，其他不同基因种、血清群致病性钩体上述基因翻译后氨基酸序列相似性为89.42%～98.63%(LigB)、92.82%～100%(Loa22)和98.53%～100%(LipL32)。

M：DNA Marker图1 抗原蛋白编码基因在不同钩体中的分布情况Fig.1 Distribution of genes encoding antigenic proteins in different Leptospira

2.2 T-B联合抗原表位预测结果及表位选择 根据T和B细胞表位预测排序及其序列重合情况，确定30个候选T-B联合抗原表位(表2)。

2.3 抗原表位肽芯片中各表位免疫反应性 芯片扫描结果显示，大多数抗原表位肽能与大鼠抗问号钩体全菌-IgG产生杂交信号。其中，LigB-6、LigB-10、LigB-11、LigB-15、LigB-16、LigB-17、LigB-20、Loa22-3、LipL32-3有很强的杂交信号，LigB-1、LigB-7、LigB-9、LigB-19、LipL32-4杂交信号较强，其余抗原表位杂交信号微弱(图2)。

表2 钩体主要外膜蛋白抗原表位预测结果Tab.2 Predicted antigenic epitopes of major outer member proteins in leptospira

图2 表位芯片系统检测优势抗原表位结果Fig.2 Predominant antigenic epitopes detected by the epitope chip system

3 讨 论

钩体病又称Weil’s病，是全世界流行的人兽共患传染病。鼠、猪和犬是自然界重要宿主，钩体随动物尿液排出污染环境，人通过接触疫水、屠宰牲畜间接接触病原菌而感染[14-16]。

注射疫苗是防治钩体病的方法之一。通常，易与抗原识别受体或抗体结合的功能性表位位于抗原物质表面，故本研究选取钩体外膜蛋白作为候选抗原研究对象。Lig家族蛋白是钩体感染时的主要抗原，其中LigB广泛分布于不同血清群致病钩体，Conrad等构建的LigB蛋白保守区域/氢氧化铝佐剂亚单位疫苗在仓鼠模型中有效率达87.5%～100%[9]；OmpA家族蛋白Loa22是钩体感染过程中明显上调表达的抗原，Loa22蛋白与钩体显微凝集试验阳性血清的ELISA敏感性和特异性分别为77.84%和86.15%，壳聚糖递送loa22基因DNA疫苗在小鼠模型中有较高的免疫原性[10, 17]；LipL32是钩体外膜中含量最高的蛋白，病人血清中可以检查出抗该蛋白的IgM，重组表达LipL32蛋白与卡介苗混合接种仓鼠后具有显著的免疫保护作用[7-8, 18]；以上研究提示上述3种钩体外膜蛋白是良好的候选疫苗靶点。

表位疫苗是一种新型基因工程疫苗，将筛选出的优势多抗原表位整合至特定载体后，能有效刺激机体产生细胞和体液免疫应答，提高免疫保护作用。研究证实表位疫苗有良好的开发前景，如：流感通用多表位疫苗M-001在临床试验中对甲型、乙型流感有广泛的免疫保护作用[19]；布鲁氏菌Omp2b蛋白T-B联合抗原表位疫苗可以产生特异性的体液和细胞免疫应答[20]；口蹄疫多表位疫苗免疫豚鼠后有良好的免疫保护作用[21]。目前钩体表位疫苗的研究较少，Kumar P等2021年应用免疫信息学和结构分子动力学预测了钩体的抗原表位及其免疫原性[22]，Pissawong T等2020年发现LipL3293-272肽段有很强的免疫原性[23]。综上研究提示基于有效抗原筛选的优势表位有望为钩体表位疫苗的研制提供支持。

本研究选取LigB、Loa22、LipL32共3个钩体主要外膜蛋白作为代表进行研究，结果证实LigB、Loa22、LipL32均广泛存在于不同血清群的致病性钩体中，是抗原肽疫苗的有效候选蛋白(图1)。各抗原蛋白氨基酸序列在不同血清群的钩体中相对保守，其中56601株、56606株、56607株、56608株、56609株、56610株同属L.interrogans基因种，上述同基因菌株间氨基酸序列相似性高达98.46%(LigB)、99.4%(Loa22)、100%(LipL32)，56602株和56615株分别为L.borgpetersenii和L.weilii基因种，序列保守，但相似性较L.interrogans基因种之间略低。根据生物信息学软件预测抗原表位的评分情况，我们选择30个T-B联合抗原表位进行研究。以往我们采用传统的噬菌体展示肽结合免疫印迹法筛选抗原表位，存在实验步骤繁杂、时效性不佳的缺点，此次合成短肽结合芯片检测方法相比噬菌体展示肽结合免疫印迹法更方便易行，可一次性批量检测众多抗原表位的免疫原性。抗原肽芯片扫描结果显示：预测T-B联合抗原表位与抗钩体全菌IgG反应时，LigB-6、LigB-10、LigB-11、LigB-15、LigB-16、LigB-17、LigB-20、Loa22-3、LipL32-3的免疫反应性明显高于其他表位，且上述抗原肽对各不同血清群钩体抗血清IgG反应性基本一致。

综上所述，本文采用芯片法筛选钩体外膜蛋白优势表位，在LigB、Loa22、LipL32蛋白中共获得9个优势表位，上述表位序列保守且与不同血清群钩体抗血清均可发生交叉反应，可作为钩体抗原肽疫苗侯选表位。

利益冲突：无

引用本文格式：胡玮琳, 夏文浩, 任雨轩. 芯片法筛选钩端螺旋体外膜蛋白抗原表位[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：970-974. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.149