滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物感染贝氏柯克斯体的调查

洪汝丹,刘思彤,贺琪楠,罗云燕,朱俊洁,艾志琼,尹家祥

Q热是一种由贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii, 简称Cb)所引起的人兽共患病，在世界范围内广为流行。Q热所引起的持续性慢性感染尤为严重，其中心内膜炎、血管持续感染和Q热疲劳综合征等感染症状备受关注[1]。反刍动物牛羊被认为是感染人类Q热的主要来源[2]。啮齿动物是Cb重要的储存宿主[3]。有研究显示Cb在啮齿动物中的阳性率与反刍动物的Cb感染率存在一定相关性[4-5]。目前，已在35种不同的啮齿动物中发现了Cb感染的证据，分属26个不同的种属[6]。有研究认为，在疫源地受到Cb感染的啮齿动物会通过迁徙行为聚集在农场附近，因为农作物会作为它们度过秋冬季的食物来源，而此时正是反刍动物繁殖的时期，Cb在孕兽体内的感染机制会进一步被激活，从而认为啮齿动物是Cb感染反刍动物的真正来源[7]。此外，物种特异性生态群落结构和栖息地环境需求可以决定宿主和病媒接触的概率，即使同一属的物种之间Q热感染状况也会有所差异[8]。

滇西鼠疫疫源地鼠形动物种类丰富，物种复杂多样，适于各类人兽共患病宿主动物、媒介昆虫的生存繁殖和病原体的维持传播，疫源地还存在着家鼠和野鼠不同类型的鼠疫疫源地，在进化中形成特有的生物群落结构[9]。在这种特殊的生物地理群落中鼠形动物Q热的流行分布如何未见报道，为此，本研究通过滇西鼠疫疫源地中捕获的野外鼠形动物采用巢式PCR对鼠形动物肝/脾脏组织DNA样本进行扩增，再对扩增的阳性DNA片段测序和序列分析，旨在调查此地区野外鼠形动物Cb的感染情况，加强滇西鼠疫疫源地Q热的防控，对降低Q热等人兽共患病发生的风险具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样本采集 2015年12月至2016年10月，以野鼠鼠疫疫源地云南省玉龙县和剑川县，家鼠鼠疫疫源地云南省梁河县为采样点，玉龙鼠疫疫源地以文笔山及周围地区，剑川鼠疫疫源地以石龙、东山地区，梁河鼠疫疫源地以芒东、河西、囊宋等地区为采样调查区域。在不同季节(春、夏、秋、冬)、不同海拔梯度(玉龙鼠疫疫源地以海拔2 800 m划分；剑川鼠疫疫源地以海拔2 450 m划分；梁河鼠疫疫源地以海拔1 000 m～、1 200 m～及海拔1 400～1 910 m划分)、不同生境(耕地、林地、灌丛、耕地林地/耕地灌丛交界)，使用夹夜法进行野外捕鼠，以花生为诱饵，沿一定地势放置鼠夹，傍晚放置，晨起收集捕获的鼠形动物。

1.2 样本处理及鼠种鉴定 捕获的鼠形动物带回实验室后根据其外形进行分类鉴定。用75%酒精擦拭鼠形动物的体表，于生物安全柜内无菌解剖，取肝脏和脾脏存于-40 ℃备用。共获取2 524份肝脾样本，对采集的肝脾样本进行DNA提取时，优先使用脾脏，若脾脏因在捕获鼠形动物过程中受损，则选择肝脏进行DNA提取。

1.3 DNA提取和巢式PCR扩增 用无菌眼科剪将野外鼠形动物的肝/脾样本取5～10 mg组织，使用磁珠法微量细胞/组织基因组DNA提取试剂盒及全自动核酸自动提取仪(北京百泰克生物技术有限公司)进行DNA提取。

采用巢氏PCR来扩增目的CbCom1基因片段。通过两轮扩增，外引物为Com1 F1和Com1 R1，内引物为Com1 F2和Com1 R2(见表1)[10]，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所提供的Cb国际标准菌株序列RSA493为阳性对照物，反应体系及反应条件见表2和表3。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为电压120 V、电流80 mA，电泳30 min，加样量3 μL/孔。使用Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)(美国Thermo Fisher Scientific 公司)和DNA MarkerI(北京 Biomed 公司)，三通道实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)进行PCR检测。PCR产物的测序送上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 Cb Com1基因巢氏PCR引物Tab.1 Nested PCR primers for Cb Com1

表2 Cb Com1基因巢氏PCR反应体系Tab.2 Reaction system of nested PCR for Cb Com1

1.4 测序与统计分析 登录(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，将测序成功的阳性序列进行BLAST比对，运用软件Megalign和MEGA7.0分析Cb的

表3 Cb Com1巢氏PCR反应条件Tab.3 Reaction conditions of nested PCR for Cb Com1

同源性并构建系统发育树，探索其进化来源。应用Excel 2010和SPSS20.0软件，采用χ2检验和Fisher确切概率法分析不同疫源地鼠种、性别、生境、海拔梯度、季节等因素Cb在野外鼠形动物的流行分布情况(检验水准α=0.05)。

2 结 果

2.1 滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物Cb感染情况 共检测2 524份DNA样本，Cb阳性样本23份，阳性率为0.91%。有2目4科7属8种野外鼠形动物检测出Cb阳性，分别是齐氏姬鼠0.64%(5/780)、中华姬鼠2.19%(6/274)、黄胸鼠0.54%(1/184)、社鼠3.64%(2/55)、锡金小鼠1.37%(1/73)、大绒鼠1.03%(5/485)、臭鼩鼱4.08%(2/49)、毛猬1.96%(1/51)，见表4。

表4 滇西鼠疫疫源地不同种类野外鼠形动物Cb感染情况Tab.4 Cb infection in wild small mammals of different species in the natural plague foci of western Yunnan

2.2 不同疫源地、海拔梯度、生境、季节及性别间Cb感染情况 玉龙鼠疫疫源地野外鼠形动物Cb阳性率为0.34%，剑川鼠疫疫源地为1.46%，梁河鼠疫疫源地为0.80%，3个疫源地野外鼠形动物Cb阳性率不同(χ2=6.575，P=0.037)，剑川鼠疫疫源地Cb阳性率高于玉龙鼠疫疫源地(P<0.017)，其余疫源地两两比较无差异。玉龙鼠疫疫源地海拔2 800 m以下和2 800 m以上野外鼠形动物Cb阳性率分别为0.51%和0.30%(P>0.05)。剑川鼠疫疫源地海拔2 450 m以下和2 450 m以上野外鼠形动物Cb阳性率分别为0.13%和4.64%，海拔梯度2 450 m以上Cb阳性率高于2 450 m以下(χ2=28.504，P<0.001)。梁河鼠疫疫源地海拔1 000～1 200 m、1 200～1 400 m和1 400～1 910 m野外鼠形动物Cb阳性率分别为0.56%、0.48%和1.27%(P>0.05)。不同生境野外鼠形动物的Cb阳性率耕地、林地、灌丛、耕地林地/耕地灌丛交界分别为1.09%、0.61%、0%和1.94%，不同生境Cb感染无差异(P=0.071)。野外鼠形动物Cb阳性率春季为2.44%，夏季0.55%，秋季0.37%，冬季0.62%，不同季节Cb阳性率不同(χ2=17.730，P=0.001)，春季高于秋季(P<0.008)，其余季节两两比较无差异。Cb阳性率雄性为0.96%，雌性为0.86%，性别间Cb感染差异无统计学意义(χ2=0.076，P=0.782)。(见表5)。

表5 不同影响因素野外鼠形动物Cb感染情况Tab.5 Cb infection in wild small mammals of different influencing factors

2.3 CbCom1基因同源性分析 滇西鼠疫疫源地样本内部的同源性为98.9%～100%。选取部分有代表性的参考序列与滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物样本测序序列一同构建同源性分析图，结果显示本次调查所得到的基因序列与来自伊朗单峰骆驼(MH373681)、韩国长角血蜱类(AY342038)、美国安氏革蜱(Z11828)、保加利亚欧柳莺(MH703039)、俄罗斯全沟硬蜱(MH703042)、中国云南YS-8菌株(AF318148)和中俄边境黑瞎子岛啮齿动物(JX522479)的Cb序列同源性都在99.0%以上。与美国海狮的胎盘中检出的Cb序列GU797241的同源性为96.3%～96.8%，与澳大利亚淡水小龙虾螯虾立克次体序列EF413062的同源性为90.7%～91.2%(见图1)。

图1 Cb Com1基因片段同源性分析Fig.1 Homology analysis of the Com1 gene fragment of Cb

2.4 CbCom1基因系统发育分析 经BLAST匹配对比分析，23份阳性样本Com1基因序列和GenBank收录的部分参考序列构建了系统发育树。结果显示所有样本和参考序列都隶属于一个大分支，和中俄边境黑瞎子岛啮齿动物(JX522479)、意大利囊形扇头蜱类(KT071010)、中国云南YS-8菌株(AF318148)、俄罗斯全沟硬蜱(MH703042)、澳大利亚条纹袋鼠(HM804027)、澳大利亚淡水小龙虾螯虾(EF413062)、保加利亚欧柳莺(MH703039)、印度荷斯坦牛黑白花奶牛(MK902739)、印度牛(MK902734)、美国安氏革蜱(Z11828)、韩国长角血蜱类(AY342038)、伊朗单峰骆驼(MH373681、MH373682)构成一个小分支。虽然美国海狮的胎盘中检出的序列GU797241和HM237793与以上参考序列和样本呈现出一定的差异性，但仍隶属于相同小分支。另一小分支为伊朗鸽锐缘蜱检出的类柯克斯体内共生体MF359024，与上述分支里的意大利囊形扇头蜱类(KT071010)和韩国长角血蜱类(AY342038)相比，提示类柯克斯体内共生体在不同地区不同蜱种之间存在一定的差异性；与外群俄罗斯Cb菌种质粒QpDV的开放阅读框架(ORF)的片段序列X84772为不同分支(见图2)。

注：■玉龙鼠疫疫源地样本 ▲剑川鼠疫疫源地样本 ●梁河鼠疫疫源地样本图2 基于Cb Com1基因片段构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic analysis of the Com1 gene fragment of Cb

3 讨 论

Q热在世界范围内是一种广为流传的人兽共患病，且宿主动物众多。至今发现野生动物能自然感染Q热者已达90种以上，其中以啮齿类动物最多[11]。国内报道，在众多啮齿动物中，喜马拉雅旱獭、达乌利亚黄鼠、褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、黑线姬鼠、大林姬鼠、灰仓鼠、社鼠等被检测出Cb感染；国外报道感染Cb的啮齿动物多达26属35种，遍布亚洲、非洲、欧洲和北美洲[12]。在本次滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物Cb感染的调查中，齐氏姬鼠、中华姬鼠、锡金小鼠、大绒鼠、臭鼩鼱、毛猬为首次检测出Q热病原体Cb，尤其是食虫目中的臭鼩鼱和毛猬，提示存在Cb感染的鼠形动物并不仅仅局限于啮齿目动物。在世界各国对啮齿动物Cb感染情况的调查分析中，褐家鼠的Cb阳性率最高[13]，但在本次实验中并未在褐家鼠中检出阳性，这可能与被检测的褐家鼠样本较少有关。

滇西鼠疫疫源地不同生境(耕地、林地、灌丛、耕地林地/耕地灌丛交界)野外鼠形动物Cb感染除灌丛外，其余3种生境里都检出了野外鼠形动物存在Cb感染。有血清学实验研究指出野生啮齿动物的Q热感染情况和绵羊的Cb感染率相关，与家畜(牛羊等动物)共享栖息环境的野生啮齿动物有更高的Cb阳性率；但同时也发现没有与家畜接触的生境中，啮齿动物也存在Cb感染的情况(如生活在灌木丛内)，但阳性率极低，说明啮齿动物在疫源地对维持Q热在自然界的循环起到一定作用[12]。有研究显示野外鼠形动物的Cb带菌状态和它们所在的生存环境存在一定的关联[14]。但针对野外鼠形动物不同生境Cb感染状况的研究极少，本次实验结果也缺乏相关系统的研究报道做一些对比分析。剑川鼠疫疫源地的Cb阳性率高于玉龙鼠疫疫源地，玉龙和剑川鼠疫疫源地同属于野鼠鼠疫疫源地，在地理环境特征，生态群落结构方面都极其类似，但在野外鼠形动物Q热流行分布上却不同，这可能与两大疫源地之间的内部结构存在一定的差异有关。滇西鼠疫疫源地春季野外鼠形动物Cb阳性率高于秋季。在以人为基础的Q热研究中，春季是Q热的高发季节，其中的高危因素是与反刍动物接触，从而导致Cb感染率的季节性上升，这一结论与本次实验结果较为一致[15]，滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物春季Cb感染情况是否与反刍动物的接触有关，这一点还缺乏更为系统的调查。课题组前期研究发现滇西鼠疫疫源地宿主动物寄生蚤的季节消长规律与此次野外鼠形动物Cb感染情况存在一定的联系，滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物的Cb感染情况可能与一些节肢动物的生活史规律、季节消长规律、宿主寄生嗜性和宿主生活状态有一定关联[16]。蜱通常被认为是Cb感染反刍动物和野生动物的传播媒介，也是维持其传播的载体，甚至可以直接将Cb传播给人类，有研究显示，野生鼠形动物→蜱→家畜的关系链存在于不同的地理环境中，使得Q热在不同宿主动物中的流行分布更加开放多元化[17]。因此，监测宿主动物和节肢动物之间的季节消长情况有利于探索动物群落的动态变化与Q热流行分布的内在结构规律。不同海拔梯度野外鼠形动物Cb感染情况，剑川疫源地的高海拔地区野外鼠形动物有较高的阳性率，这与章域震等[18]研究所得出的Q热流行分布在云南省南部和西部相对低海拔地区和江河峡谷地区的结论有所不同，在云南以往的研究中，针对Q热的研究对象，主要是一些大型的反刍动物如牛羊等，且采样地多聚集在低海拔地区，因此系统地调查Q热在不同宿主动物不同海拔梯度中的流行分布情况，将会使Q热疫情动态监控更加全面具体。

本次实验结果23份Cb阳性样本Com1基因测定序列同源性分析显示，除美国海狮的胎盘中检出的Cb序列GU797241和澳大利亚淡水小龙虾螯虾立克次体序列EF413062外，其余参考序列与滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物样本的同源性为98.9%～100%，说明在世界范围内CbCom1基因片段高度保守。进化分析显示所测序列与云南YS-8菌株序列[19]同属一支，其同源性分析达100%，提示滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物存在的Cb感染状况对人类存在一定的致病风险，但CbCom1基因因其进化的高度保守性，还需一些更为系统的研究来阐述这个问题。

本研究通过Com1基因扩增检测滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物的Cb阳性情况，该基因属于单拷贝基因，其序列高度保守，是分子系统学中的一种极有价值的分子标记，在构建生命树的主干及主干和末梢之间的分枝中具有重要的作用。相对于多位点可变数量串联重复分析[20]、单核苷酸多态性分型[21]等高精度分型方法来说，使用单拷贝基因Com1检测Cb相对单一。目前宏基因组二代测序技术(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)在Cb感染检测中逐渐兴起，有研究通过mNGS对珠海市某医院不明原因急性发热患者的血浆样本进行检测，验证了mNGS是一种可靠、有效的实验室诊断Q热的方法[22]。Jiao Jun等[23]使用mNGS对云南微小裂头蚤的DNA样本进行快速评估，再使用PCR结合DNA测序分析来鉴定Cb在云南微小裂头蚤中的感染。Cb分子检测方法多样，但也存在着方法造价昂贵，能否快速简便检测等的问题。而Cb菌株分子特征对于比较不同动物物种的基因型、追踪疾病暴发和评估毒株基因型与毒力之间的关系至关重要，因此，寻求精确快速简单经济的Cb分型检测方法也是未来需要继续深入研究的问题。

综上，滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物Cb阳性率较低，但野外鼠形动物Cb感染广泛，其中齐氏姬鼠、中华姬鼠、锡金小鼠、大绒鼠、臭鼩鼱、毛猬为首次检测出Q热病原体Cb。CbCom1基因片段在野外鼠形动物中呈现出高度保守的流行与分布。鼠疫疫源地野外鼠形动物Cb感染的调查，对有效防控人群的Q热感染有重要意义。

利益冲突：无

引用本文格式：洪汝丹,刘思彤,贺琪楠,等. 滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物感染贝氏柯克斯体的调查[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：1031-1038. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.146