一起由空肠弯曲菌所致食源性疾病暴发事件的流行病学及病原学溯源分析

章乐怡，楼辉煌，李 毅，胡玉琴，林谦阁，周珊慧，符 彬，李晟恺

弯曲菌(Campylobacter)被认为是发展中国家和发达国家的细菌性腹泻疾病的主要原因之一，大多数弯曲菌病是由于空肠弯曲菌引起。弯曲菌的来源广泛，而人类接触零售肉类已被确定为弯曲菌病的主要危险因素[1]。美国2019年的一份报告中指出弯曲菌是最常见的食源性病原菌，每10万人中有19.5人感染[2]。近几年我国的弯曲菌暴发事件也时有发生，北京、苏州等地先后报道发生由弯曲菌感染所致的胃肠炎暴发事件[3-5]。2021年以来本市也发生多起起由弯曲菌引起的食源性疾病暴发事件。本研究针对2021年在温州市某学校发生的一起急性食源性疾病暴发事件，通过对相关样本进行PCR快筛、双孔滤膜法分离培养病原菌，并通过PFGE分型、全基因组测序，为今后弯曲菌引起的暴发事件的实验室确诊及溯源分析提供经验。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2021年5月，温州某小学发生食源性疾病突发事件，学生病例均多日在学校连续就餐，食谱中出现三黄鸡。采集食堂环境涂抹样本 3份，食堂员工(无症状)粪便标本6份(14日采样)，学生病例粪便标本23份(因发病时间不同，于5月11日、12日、14日3天陆续采样)，鉴于食谱中出现过三黄鸡，但无留样，于23日采集4份提供食堂三黄鸡的某禽业公司销售的三黄鸡。

1.2 主要仪器和试剂 全自动微生物质谱鉴定系统MALDI Biotyper Smart(布鲁克北京科技有限公司)；FilmArray快速多重 PCR 分析系统(法国生物梅里埃)、CHEF Mapper 型脉冲场凝胶电泳仪、Gel XR 型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；FilmArray胃肠道疾病(GI) 测试条(法国生物梅里埃)；双孔滤膜法弯曲菌培养基(ZC-CAMPY-001)、弯曲菌琼脂稀释法抗生素最低抑菌浓度(MIC)检测试剂盒(ZC-AST-001)购自青岛中创汇科科技有限公司；全基因组DNA提取试剂盒(购自天津诺禾致源生物信息科技有限公司)，所有试剂在有效期内使用。测序由杭州微数生物科技有限公司完成。

1.3 实验室检测

1.3.1 PCR检测 对第1次采样(11日)的9份腹泻学生粪便样本用荧光定量PCR法进行了诺如病毒核酸检测，对第2次采样(12日)的10份腹泻学生粪便样本，制成2个混样(5份为一个混样)，采用胃肠道疾病(GI) 测试条，进行13 种细菌、5 种病毒、4种原生动物共22 种常见胃肠道病原快速筛查。

1.3.2 弯曲菌分离培养 对27份样本，包括14份学生病例样本(包括12日采样的10份样本和14日采样的4份样本)、6份食堂员工粪便样本(14日采样)、3份环境涂抹样本、4份三黄鸡进行了分离培养，采用双孔滤膜法分离弯曲菌，42 ℃微需氧环境下培养48 h，镜检形态为G-、弧形、S形或螺旋形等可疑菌落进一步进行生化鉴定，分型鉴定采用质谱法。

1.3.3 药敏试验 根据CLSI推荐的弯曲菌琼脂稀释法(Agar Dilution Method)对分离的空肠弯曲菌菌株进行药敏试验。包含了7大类11种抗菌药物：氨基糖苷类：庆大霉素(Gentamicin，GEN)、链霉素(Streptomycin，STR)；大环内酯类：红霉素(Erythromycin，ERY)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)；喹诺酮类及氟喹诺酮类：萘啶酸(Nalidixic acid，NAL)；环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)；氯霉素类：(氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、氟苯尼考(Florfenicol，FLO)；四环素类：四环素 (Tetracycline，TET)；林可酰胺类：克林霉素(Clindamycin，CLI)；酮内酯类：泰利霉素(Telithromycin, TEL) 等11种抗生素。空肠弯曲菌ATCC33560 作为质控菌株。42 ℃微需氧培养48 h后读结果。记录弯曲菌对各类药物的最低抑菌浓度值(MIC值)，根据美国NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)标准(https://www.cdc.gov/narms/antibiotics-tested.html)对弯曲菌的耐药进行判定。耐药折点值：AZI(≥8 μg/mL)、CIP(≥4 μg/mL)、ERY(≥32 μg/mL)、GEN(≥8 μg/mL)、TET(≥16 μg/mL)、FLO(≥8 μg/mL)、CHL(≥32 μg/mL)、STR(≥16 μg/mL)、NAL(≥64 μg/mL)、TEL(≥16 μg/mL)、CLI(≥8 μg/mL)。

1.3.4 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法 空肠弯曲菌的PFGE分子分型操作方法按照美国PulseNet公布的标准程序http://www.cdc.gov/pulsenet/protocols/campy_protocol.pdf进行。细菌悬液调整比浊值为5.5～6.0个麦氏单位，限制性内切酶使用SmaⅠ，酶切时间为4 h，PFGE电泳条件 6.76～35.38 s，电泳时间18 h。电泳图谱使用BioNumeric 7.6软件分析菌株同源性。

1.3.5 全基因测序 将菌株接种至血平板复苏活化，42 ℃微需氧培养，刮取新鲜菌落, 用全基因组DNA试剂盒进行提取后外送测序。序列结果用Fastqc软件进行质量检测，使用国家致病菌识别网上的基因组数据分析软件将原始序列进行de novo 组装，序列组装以后进行拼接，数据分析上传pubmlst网站(https://pubmlst.org/organisms/campylobacter-jejunicoli/)进行基因组水平的遗传特征分析。

数据上传抗生素耐药性数据库ncbi/AMRFinder查找空肠弯曲菌基因组中的耐药基因并进行比较[6]。设置%ID 的阈值为90%，最小长度比例为 90%。毒力基因则参照毒力因子数据库(Virulence Factors Database, VFDB, http://www.mgc.ac.cn/VFs/)进行查找分析。

2 结 果

2.1 流行病学结果 2021年5月11日，区疾控中心接到某小学报告，该校多个班级学生出现腹痛、腹泻。现场流行病学调查显示，这个学校共有670名学生，教职工48名。食堂有10名工作人员，自述近期无腹泻、呕吐症状。共发现学生病例23例，学生罹患率为3.43%(23/670)，均为轻症病例，无住院病例。23例病例中，临床表现以腹泻、腹痛为主占91.30%(21/23)，恶心占60.87%(14/23)，发热占47.83%(11/23)，呕吐39.13%(9/23)。第1例患者和最后1例患者的发病时间分别是5月9日和5月12日。

2.2 卫生学调查 学校为学生提供中餐，由学校食堂烧制。查看食堂5月6日-12日间的食材，其中有腊鸡翅、三黄鸡、鳕鱼、排骨、西红柿、黄瓜、鸡蛋等，食堂无专用熟食加工间，加工间所用刀具和砧板，放置于同一板架，无生熟标识。

2.3 多病原PCR筛查结果 因基层疾控初步怀疑诺如病毒，第1次采样(11日)的样本仅进行诺如病毒核酸检测，结果均为阴性。对12日采样的10份学生病例样本制成2份混样用FilmArray胃肠道疾病(GI) 测试条筛查后，结果表明两份混样弯曲菌属核酸均阳性。

2.4 培养结果 对27份样本进行弯曲菌培养，结果7份学生病例样本中检出空肠弯曲菌(其中12日采样的10份样本检出3份，14日采样的4份样本全部检出)，蒸柜容器把手涂抹、刀具砧板涂抹样本均检出空肠弯曲菌。后续采集的4份三黄鸡2份检出结肠弯曲菌。

2.5 空肠弯曲菌PFGE分型结果 9株空肠弯曲菌(分别来自7份病例样本和2份环境涂抹样本)，经PFGE分子分型后进行聚类，结果显示9株空肠弯曲菌分为4种带型，其中3份病例样本和环境涂抹样本(蒸柜容器把手涂抹) 的分离株克隆聚集成簇，带型完全一致，相似性为100%，标记为WZKW050 型，系同一克隆株；另2份病例样本和环境涂抹样本(刀具砧板涂抹)为同一带型，这3株带型标记为 WZKW051型；其他两份病例样本的PFGE带型均不同，病例5的PFGE带型和WZKW051型相似度为92.3%，病例7的PFGE带型则和其他菌有较大的差异，相似度为仅达60%。如图1。

图1 9株空肠弯曲菌PFGE聚类结果图Fig.1 PFGE clustering results for nine Campylobacter jejuni isolates

2.6 空肠弯曲菌药敏结果和耐药基因结果 9株空肠弯曲菌对7大类11种抗生素的耐药率结果表明，分离株对四环素类和喹诺酮类耐药率较高，分别为77.8%(7/9)、55.6%(5/9)。8株弯曲菌分离株对至少一类抗菌药物耐药，1株菌株全部敏感，两株病人菌株表现出多重耐药。其中MLST和PFGE相同的菌株的耐药谱不完全一致。见表1。

经ncbi/AMRFinder分析发现：9株弯曲菌共含有blaZ、blaI、blaOXA-193、blaOXA-184、aadD1、aph(2″)-If、aph(3′)-IIIa、gyrA、tet(K)、tet(O)、catA13、50S_L22等12种耐药基因，9株弯曲菌分离株均检测AMR基因阳性，6株菌携带3种以上抗生素耐药基因。而发现最多的耐药基因为blaOXA-193，blaOXA-193编码β-内酰胺类抗生素的耐药性。其次为gyrA、tet(O)，分别编码喹诺酮类、四环素类的耐药性。其中7株四环素耐药的菌株中5株携带tet(O)、tet(K) 基因。4株喹诺酮类耐药的菌株全携带gyrA基因，所有gyrA基因86位点发生T-I突变，有2株分离株核蛋白体50S_L22位点发生了突变。

表1 9株空肠弯曲菌分离株的药敏试验及和耐药基因结果Tab.1 Antimicrobial susceptibility testing and resistance genes for nine Campylobacter jejuni isolates

2.7 空肠弯曲菌基因组基本信息和cgMLST分析 基因组序列长度和 GC 含量是生物最基本的遗传特征。9株弯曲菌基因组大小在1 521 609～1 724 352 bp，基因数量在1 693～2 285，GC含量在52.48%～53.93%，基因平均长度在781.49～945.87 bp。其中MLST和PFGE分型相同的菌株的基因组大小、基因数量以及GC含量不完全一致，但非常接近，由于纯二代测序的细菌基因组完整度没有达到完成图的水平，故样本间基因组统计参数可能会有差异，见图2。

每个弯曲菌的cgMLST类型都是利用弯曲菌核心基因组的1 343个位点的等位基因序列进行分配的[7]。按cgMLST200分类，有7株弯曲菌分别属于cgMLST200-186和cgMLST200-54两个群，另2株菌未被分群。按7个管家基因MLST分类，9株空肠弯曲菌分为4种ST型(ST2031、ST11105、ST7533、ST11106)，其中ST11105、ST11106是我们提交至数据库产生的新ST型。蒸柜容器把手涂抹分离的空肠弯曲菌和3份病例样本分离株同为 ST11105型，cgMLST聚类在一起，属cgMLST200-54群；刀具砧板表面涂抹分离的空肠弯曲菌和另2个病例分离株同为ST2031型，属cgMLST200-186群；病例5和病例7的ST型为ST11106和ST7533。ST7533和最接近的cgMLST的错配高达1 100个等位基因，是一株数据库里少见的类型。

图2 9株空肠弯曲菌分离株的最小进化树圈图Fig.2 Minimum spanning tree of nine Campylobacter jejuni isolates

2.8 空肠弯曲菌全基因组毒力基因结果 测序结果上传到毒力基因数据库，结果表明9株弯曲菌基因组都包含多个毒素基因，共获得168个毒力基因，其中86个分别属于与侵袭力、黏附(定殖)、外毒素、翻译后修饰、免疫调节、运动扩散相关的6大类毒力基因。MLST和PFGE分型相同的菌株所含的毒力基因完全一致，其中ST11105的菌株含126个毒力基因，ST2031的菌株含123个毒力基因，均涵盖了上述6大类毒力基因。

3 讨 论

弯曲菌被认为是发展中国家和发达国家的细菌性腹泻疾病的主要原因。弯曲菌也是本市主要的食源性致病菌，监测数据表明2017-2019年腹泻病例弯曲菌检出率为 10.2%，高于同一时期本市两家监测点医院沙门菌、副溶血弧菌的阳性率(0.9%、8.1%)[8]。

本起弯曲菌事件发生在学校，且传染链较复杂。基层疾控中心对这事件的最初判断病原体为诺如病毒，故对第一次样本的检测仅限于诺如病毒，结果均为阴性。后续样本我中心采用胃肠道多病原体测试条对混样快筛后进行弯曲菌培养。但由于样本没有及时上送且保存不当，部分样本没有成功分离出弯曲菌。故建议对今后应急事件中不能及时培养的样本需4 ℃保存，在24 h内完成增菌。

本研究对分离的9株空肠弯曲菌 PFGE 分型及全基因组聚类分析结果显示，9株空肠弯曲菌分为4种克隆型，表明本次来源复杂，至少有4种弯曲菌克隆型存在。发病病例陆续4 d均有出现，外环境样本采集离首发病例已经5 d，然而外环境样本涂抹分离的空肠弯曲菌与陆续采样的病例分离株基因型完全一致，表明外环境污染的弯曲菌一直存在，且有可能再次污染食物导致学生陆续发病。然而由于没有剩余的食品无法进一步溯源。鉴于前几年本市弯曲菌食品风险监测中鸡肉空肠弯曲菌携带率高达43.2%[9]，后期我们对提供学校食材的禽业公司销售的三黄鸡进行采样，检出结肠弯曲菌，虽不能溯源到本次事件，但说明禽业公司的鸡受弯曲菌污染的严重程度。

近年来全基因组测序技术被广泛用于食源性疾病研究，我国各地弯曲菌病的监测和暴发也开始使用WGS技术。WGS 有较高分辨率、准确性高、重复性好，可用于确定疾病暴发中分离株的相关性，以揭示细菌的传播关系及疾病的来源[10]。测序数据在经处理和分析后可用来快速识别群落的基因型特征，如毒力基因和耐药基因等。cgMLST利用高密度的核心基因组作为标记，构建高分辨率的物种分型结果，cgMLST200是在cgMLST基础上允许分离株之间有200个等位基因的差异进行分型[11]。本起突发事件全基因组cgMLST的聚类和PFGE分型结果一致，表明这几种分子分型方法均可以用来溯源，从分子水平证实了本次事件是由空肠弯曲菌污染所致。

病原菌的毒力因子与其疾病的严重程度密切相关，多个毒力基因可能同时起作用，使弯曲菌具有相对较高的毒力，了解病原菌的毒力基因情况对预测疾病有一定的意义。结果表明分离的弯曲菌的所有基因组都包含多个毒素基因，这表明几乎所有的分离株都具有潜在的致病性。

空肠弯曲菌的药敏及全基因组耐药基因结果表明，携带耐药基因的菌株并没有完全在表型中表达。在4株喹诺酮类药物耐药菌株中均发现了gyrA突变，gyrA基因86位点发生T-I突变。gyrA的T86I是喹诺酮类耐药弯曲菌分离株中最常见的位点突变[12-13]。2株分离株核蛋白体50S_L22位点发生了突变，但对阿奇霉素和红霉素并没有耐药，与文献报道一致[14]，这个突变是和大环内酯类耐药相关的，当然位点突变产生抗性需要许多其他基因进行协同，通常弯曲菌23S rRNA基因2074和2075位点突变是导致大环内酯类抗生素耐药的最常见原因[14]，9株分离株均未发生这两个位点的突变。本研究结果还发现cgMLST和PFGE相同的菌株的耐药谱不完全一致，表明虽然这些菌株基因型相同，但耐药的表型和其耐药机制有关，如耐药是由于基因突变造成的，cgMLST分型并没有体现耐药基因的突变，在同一克隆群传播过程中也可能导致可移动的耐药基因或耐药基因决定簇的丢失或获得。弯曲菌病通常使用大环内酯类抗菌素治疗，而喹诺酮类抗菌药物，通常用于旅行者腹泻或胃肠炎的一般病例[15-16]，因而今后还要进一步对这类药物的耐药机制进行研究。

利益冲突：无

引用本文格式：章乐怡，楼辉煌，李毅，等. 一起由空肠弯曲菌所致食源性疾病暴发事件的流行病学及病原学溯源分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：1012-1017. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.148