徐州市7株猪链球菌病原学分析及分子分型研究

吴畏畏，童 晶，杜阳光，冯欢欢，许艳平，毕 俊，周 强，祝雯雯

猪链球菌(Streptococcussuis)是一种人兽共患病病原体，根据其荚膜多糖的抗原性，猪链球菌可分为29个血清型，其中许多血清型如1、2、5、9、14、16、28和31型可以感染人类；其中猪链球菌2型是国内外最常见的致病血清型，感染人可引起严重的中毒性休克综合征等疾病[1]。研究发现猪链球菌的致病性与荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、细胞外蛋白因子(ef)、溶血素(sly)、纤连蛋白(fbps)和谷氨酸脱氢酶(gdh)等多种毒力基因相关[2-3]。猪链球菌感染的传染源多为发病猪和健康带菌猪，猪链球菌可定殖在猪的上呼吸道(尤其是鼻腔和扁桃体)、生殖道和消化道，研究报道健康猪带菌率为20%～40%[4-5]。感染多发生在从事猪屠宰、养殖、加工和销售的人群，发病前多有和病猪或病死猪(肉)的密切接触[6-7]。本研究对2020年至2022年徐州市临床病例分离猪链球菌进行鉴定，并发现3例病人发病前均在手部皮肤有破损的情况下进行屠宰或者处理猪(肉)的操作，采集了相关环境(售卖摊、养猪场和宰杀场所)及可能传染源(猪咽拭子)等标本进行猪链球菌分离，对分离到的菌株进行毒力基因检测，并采用MLST和PFGE等分子分型方法进行溯源分析，为猪链球菌感染的诊断、治疗和科学防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统(法国生物梅里埃)，飞行时间质谱仪(郑州安图生物)，CO2培养箱(德国Binder公司)，PCR扩增仪(美国ABI公司)，脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)，普通电泳仪及凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。细菌DNA提取试剂盒(天根DP302)，PCR试剂和PFGE酶SmaI(TAKARA)，猪链球菌2型/14型诊断单克隆抗体(万泰生物)，毒力基因及管家基因引物由擎科生物工程有限公司合成。

1.2 病例信息 患者1：女，40岁；2020年4月10日左右在手部有伤情况下处理过猪肉；5月4日出现头晕、头痛、恶心、颈部疼痛，双下肢乏力等症状；5日症状加重入院，发热39.5 ℃，伴有寒战、右侧眼睑下垂、双耳听力下降等症状；8日出现昏迷转院。

患者2：男，54岁；2021年2月8日在手部有伤情况下加工生态黑猪，且过程中手被猪骨刺破；9日出现头疼、恶心、牙龈和颈部疼痛、双下肢乏力等症状；13日发热38.5 ℃入院；16日出现昏迷转院。

患者3：男，51岁；2021年11月28日，分割生态黑猪肉时手部被刺伤；12月15日出现发热、头痛等症状；24日病情加重入院；2022年1月1日发热38.7 ℃，出现昏迷转院。

1.3 分离和鉴定 2020-2022年传染病报告信息管理系统共报告3起猪链球菌感染疫情，患者分离菌株均由徐州医科大学附属医院在血培养瓶报阳性后，接种至血平板后送徐州市疾控中心。市疾控中心进行复核并开展流行病学调查和现场采样工作，主要采集未食用的猪肉、砧板残留的血液和碎肉、养殖场内猪的鼻拭子等标本，现场直接划线接种哥伦比亚血平板，同时接种增菌液培养。猪鼻拭子和外环境涂抹拭子接种选择性增菌液(含15 mg/mL多粘菌素B，30 mg/mL萘啶酮酸的脑心浸液肉汤)，增菌15 h后接种哥伦比亚血平板，与现场接种的血平板共同置于5% CO2培养箱，37 ℃培养24～48 h。挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检。对典型菌落进行生化鉴定飞行时间质谱鉴定及Vitek-compact2系统生化鉴定，阳性菌株进行血清凝集试验。

1.4 毒力基因检测 按照试剂盒说明书提取猪链球菌DNA作为模板，参照现场细菌学[8]设计引物，扩增猪链球菌经典的4种毒力基因cps2J、mrp、ef和sly。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃(cps2J、mrp)/56 ℃(ef)/51 ℃(sly)退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，引物序列见表1。

1.5 MLST分型 参考PubMLST(https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-suis)给出的MLST分子分型方案[9-10]合成aroA、cpn、dpr、gki、mutS、recA和thrA7个管家基因引物，使用菌株DNA作为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件：95 ℃变性1 min，55 ℃(aroA、gki)/52 ℃(cpn、thrA)/50 ℃(dpr、mutS、recA)退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，产物送青岛擎科梓熙生物公司测序，所得序列上传PubMLST猪链球菌数据库，引物序列见表1。

表1 猪链球菌毒力基因和MLST分型引物序列Tab.1 Virulence genes and MLST primers for S. suis

1.6 脉冲场凝胶电泳 参照中国疾病预防控制中心PulseNet China实验手册制定的常见细菌脉冲场凝胶电泳实验操作规程，使用SmaI酶切，电泳参数：1～50 s电泳8 h，5 s电泳10 h。经Gelred染色，清水漂洗后凝胶成像仪上拍摄图像。采用BioNumerisc V7.6软件对图像处理，UPGMA进行聚类分析。

2 结 果

2.1 分离培养结果 对猪鼻拭子和外环境等标本进行分离培养24～48 h，血平板上可见灰白色、半透明、直径1～2 mm的光滑菌落，菌落周圈有草绿色α溶血环，疑似猪链球菌；挑取典型单个菌落质谱分析，在飞行时间质谱结果给出可疑/可信的猪链球菌时，使用该菌落重新接种血平板分纯；分纯后的菌株及临床送检复核菌株进行革兰染色、生化鉴定和血清凝集试验，共分离鉴定出7株猪链球菌，包括3株临床患者血样本分离株、3株猪鼻拭子和1株外环境分离菌株。革兰染色镜下为典型的革兰氏阳性链球菌，多为短链或不成链的球杆菌；其中2020年与2022年病人、2021年病人和猪鼻拭子分离株均为血清2型；通过2型/14型诊断单克隆抗体，2022年采集屠宰场环境(屠宰车间挂钩血样本)分离菌株未能确定血清型，详见表2。

表2 7株猪链球菌分离鉴定情况Tab.2 Isolation and identification of seven S. suis strains

2.2 毒力基因和MLST分型结果 对分离到的7株猪链球菌进行毒力基因检测， 2021年分离的4株细菌均携带荚膜多糖基因(cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(mrp)、细胞外蛋白因子基因(ef)和溶血素基因(sly)；2020年和2022年人源分离菌株仅携带部分毒力基因，为cps2J+、mrp-、ef+、sly+。管家基因PCR扩增产物测序后通过上传PubMLST猪链球菌数据库比对，获得3种猪链球菌ST型别，均为数据库中已有型别，其中2021年4株(人源SS-2021001、猪源SS-2021002、SS-2021003、SS-2021004)猪链球菌均为ST7型；2020年和2022年病例菌株(SS-2020001、SS-2022001)为ST1型；2022年外环境菌株(SS-2022002)ST型别数据库中不存在，未上传7个管家基因等位基因号，因而未获得新的ST型别。具体7株猪链球菌体毒力基因和MLST分型结果见表3。

表3 7株猪链球菌毒力基因和MLST检测结果Tab.3 Virulence genes and MLST results of seven S. suis strains

2.3 PFGE结果 7株猪链球菌经SmaI酶切后脉冲场凝胶电泳，PFGE聚类分析显示有4种PFGE带型，其中2021年分离到的人源菌株(SS-2021001)和3株猪源(SS-2021002～004)猪链球菌带型相同，一致性为100%；4种带型之间一致性小于80%，其中2022年屠宰场外环境分离株SS2022002与其它3种带型之间一致性小于60%，PFGE聚类分析结果，见图1。

图1 7株猪链球菌PFGE分型结果Fig.1 PFGE results for seven S. suis strains

3 讨 论

目前报道人感染猪链球菌的病例多数是由于直接接触携带猪链球菌的猪所致，从事猪的养殖或者参与猪的屠宰、清洗、销售及加工等人员均属高危人群，尤其是宰杀病(死)猪者危险性更大[11]；此外，食用生或者半熟猪肉产品也被认为是引起猪链球菌脑膜炎的重要危险因素[12]。根据患者描述，患者在发病前均在手部皮肤有破损的情况下处理过猪肉，其中患者2和患者3处理时被猪骨刺伤，表明猪链球菌感染主要通过手部破损伤口或猪骨刺伤传播。患者1处理猪品种不详，患者2和患者3处理均为黑猪肉，采集样本时患者2相关养殖场黑猪均表现为正常健康状态，分离菌株毒力基因分布mrp+、ef+、sly+；患者3相关屠宰场采样时由于采样时间滞后，未采集到黑猪的样本，分离到外环境菌株毒力基因分布mrp-、ef-、sly-；生态黑猪是否高携带猪链球菌强毒株值得进一步的调查分析。

猪链球菌2型是致病性最强血清型别，也是我国人感染猪链球菌疫情的主要流行株，本研究中分离到的7株猪链球菌有6株为血清2型，3例临床感染猪链球菌病例均为血清型2型，菌株致病力强，感染患者症状严重。此外猪链球菌致病力也取决于其毒力因子，因此对分离菌株的鉴定、血清分型以及毒力基因的检测等在病人的诊断治疗和疫情处置中十分重要。猪链球菌2型的毒力基因主要有cps2J、mrp、ef和sly等，目前认为mrp和ef的表达与猪链球菌2型菌株的毒力有显著关系，常被认为是猪链球菌2型高致病性的标志[13]。本研究中2021年从患者2和三株猪鼻咽分离到的2型猪链球菌，经PCR鉴定为携带mrp、ef和sly基因的强毒株，与近年国内致病性猪链球菌2型一致。3例病例均出现发热、头疼、昏迷等症状，发展为重症病例，表现为脑膜炎型，特点是起病急、病情进展快，且均在出现昏迷症状后转院至徐州医科大学附属医院诊治，查体共同特征：白细胞异常升高，中性粒细胞百分比均>90%；脑脊液淡黄透明，潘氏实验阳性。其中患者2发病潜伏期约1 d，而患者1和患者3潜伏期均较长，由于感染途径、菌量及服药等情况差异，潜伏期长是否与菌株缺失mrp基因有关有待研究。

多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法是常见的猪链球菌分子分型方法，分型显示2021年患者2分离菌株和3株猪源菌株均为ST7型，此4株猪链球菌PFGE聚类分析显示同源性为100%，提示同一养殖场所的猪存在相互传染的情况，同时是患者2感染猪链球菌的来源。而2020年和2022年临床病例菌株为ST1型，与目前报道主要致病型猪链球菌ST1和ST7型一致[14-15]。2022年屠宰车间中的分离株ST型未定型，为1株不携带毒力基因的无致病性猪链球菌。2株ST1型猪链球菌毒力基因分布mrp-、ef+、sly+，4株ST7型毒力基因分布mrp+、ef+、sly+，携带毒力基因不完全相同，患者分离株3种PFGE带型分析显示同源性较低，此3例病例无流行病学关联。

本研究通过流调、菌株分离鉴定、毒力基因检测、PFGE和MLST等方法溯源分析，表明宰杀和处理生猪是人感染猪链球菌的高危因素，手部皮肤破损或处理时被刺伤是造成感染主要因素。此外值得关注的是2021年分离到的3株猪源性猪链球菌其来源均为生态黑猪，2022年患者描述也是处理了生态黑猪肉。今后在健康教育方面重点要对屠场工人、洗切加工处理病/死猪肉的从业人员，加强健康知识的宣传，重点人群一旦出现畏寒、发热等应该及时到大型综合性医院接受检查和治疗，以免延误诊断和治疗。

利益冲突：无

引用本文格式：吴畏畏，童晶，杜阳光，等. 徐州市7株猪链球菌病原学分析及分子分型研究[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(11)：996-1000. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.153