复发性流产绒毛组织中MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p表达水平及与血管新生的相关性

叶彩云 高翠玲 张 艺 张 继

河南省郑州市第七人民医院(450000)

与同一配偶连续发生≥2次自然流产被定义为复发性流产(RSA)。RSA对育龄女性造成生育困扰，由于RSA的致病机制尚不明确，其治疗一直是临床难题[1]。随着医学研究的进步，miRNA被证实参与各种生理及病理过程，与细胞分化、增殖、凋亡等多种生理活动密切相关[2]。有研究发现，miRNA与不育症[3]、子宫内膜异位症[4]等生殖系统性疾病之间存在联系。Zhao等[5]研究发现，原因不明性复发性流产(URSA)患者蜕膜组织内MicroRNA-146a-5p水平异常下调，且可能通过增强IFN-γ活性，参与URSA；Wen等[6]研究发现，过表达MicroRNA-515-5p可降低细胞活力，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。血管生成在妊娠中发挥重要作用，而血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成的主要作用因子，在维持妊娠中具有重要作用[7]。目前关于RSA患者绒毛组织内MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p表达水平，及其与新生血管间关系尚不明确，基于以上背景开展本研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

将2018年1月～2020年12月本院收治的RSA 84例(RSA组)以及自愿行流产手术的正常妊娠妇女60例(对照组)纳为研究对象。纳入标准：①RSA患者既往自然流产史≥1次；此次妊娠亦诊断为自然流产；孕周7～10周；B超未见胎心搏动；绒毛、蜕膜病检提示绒毛形态正常。②对照组年龄、孕周与RSA组匹配；既往无不良孕史；此次妊娠无先兆流产症状；B超检查可见胎芽及胎心搏动；绒毛、蜕膜病检提示绒毛形态正常。排除标准：平时月经紊乱者；本次妊娠期间有急慢性感染史；合并自身免疫性疾病；生殖道畸形；内分泌异常；酗酒、吸烟、吸毒等不良习惯。本研究经本院伦理委员会审批，纳入对象均签署知情同意书。

1.2 绒毛标本采集

流产手术均由资历相当的医务人员完成，术后收集绒毛组织投入已进行DEPC处理的冻存管内，-80℃保存待用。

1.3 实验仪器与试剂

①试验仪器：荧光定量PCR仪(美国ABI)、-80℃超低温冰箱(日本松下)、紫外线分光光度仪(美国Beckman)、低温台式离心机(德国Eppedorf)、电泳仪(北京六一仪器)、垂直平板电泳槽(美国Bio-Rad)。②实验试剂：MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p、VEGF逆转录引物由广州锐博生物科技有限公司合成；逆转录试剂盒购自美国Thermo公司，qPT-PCR引物购自广州锐博，VEGF抗体、U6抗体、β-actin抗兔二抗均购自美国Bioworld公司，DBA显色试剂盒购自长沙艾杰生物技术有限公司。BCA标准蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司。

1.4 实时荧光定量法(PCR)

①提取绒毛组织总RNA并检测纯度，取1μl样本，微量紫外分光光度计在260nm与280nm波长处测量其OD值，若OD值在1.8～2.0为合格。②逆转录为cDNA：使用MMLV逆转录酶oligo(dT)引物，按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit 说明书方法将RNA逆转录为cDNA，并以此为模型行qPCR。③MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p、VEGF及U6的正向引物序列分别为：5’-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3’、5'-TTCTCCAAAAGAAAGCACTTTCTG-3',5’-ATGACGAGGGCCTGGAGTGTG-3’、5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物为通用反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物由广州锐博生物科技有限公司合成。④PCR扩增，总反应体系20μl，包括2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，Forward primer 0.7μl，Reverse primer 0.7μl，cDNA 3.0μl，RNase-free H2O 5.6μl，95℃ 3min预变性，每个循环变性95℃ 10s，引物58℃退火延伸，35个循环。以U6为内参，采用2-△△CT法对RNA表达进行相对定量。

1.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)

绒毛组织研磨为粉末，根据组织大小加入一定体积裂解液充分裂解，95℃5min使蛋白变性。根据相关步骤制作10%SDS-PAGE胶，取24μg总蛋白含上样缓冲液，总体积30μl，90V电泳30min，待至分离胶时，120V电泳60～90min，90V，转膜后添加脱脂奶粉封闭1h，TBS液清洗，滴加一抗(MicroRNA-146a-5p 1：200，MicroRNA-515-5p 1：200，VEGF 1:400，β-actin1:5000)，4℃过夜；添加二抗，室温孵育1～2h，化学发光法显色，显影、定影，凝胶成像扫描系统扫描，ImageJ图像软件分析，得出各条带所对应的灰度值计算相关灰度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

RSA组年龄(28.4±2.1)岁(25～31岁)，孕周(8.7±1.5)周(7～10周)，流产史(1.7±0.4)次(1～7次)；对照组年龄(29.5±3.3)岁(22～33岁)，孕周(9.0±0.4)周(7～10周)。两组年龄及孕周无差异(P>0.05)。

2.2 PCR检测

RSA组MicroRNA-146a-5p(0.48±0.16)及VEGF mRNA(0.31±0.08)表达量均低于对照组MicroRNA-146a-5p(1.03±0.17)和VEGF mRNA(1.03±0.18)，MicroRNA-515-5p mRNA表达量(1.29±0.26)高于对照组(0.47±0.15)(均P<0.05)。

2.3 Western Blot检测

Western Blot检测结果见图1。RSA组患者绒毛组织内MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p蛋白表达量均高于对照组，VEGF蛋白表达量低于对照组(P<0.05)。

图1 绒毛组织内MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p及VEGF蛋白表达

2.4 不同流产次数RSA患者MicroRNA-146a-5p及MicroRNA-515-5p表达水平

随着流产次数的增加，RSA患者MicroRNA-146a-5p(0.69±0.20)、VEGF mRNA(0.56±0.11)表达量依次下降为MicroRNA-146a-5p(0.36±0.09)、VEGF mRNA(0.16±0.04)，MicroRNA-515-5p mRNA表达量(1.02±0.23)上升为(1.57±0.29)(均P<0.05)。见图2。

图2 不同流产次数RSA患者绒毛组织内MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p及VEGF蛋白表达

2.5 RSA组MicroRNA-146a-5p及MicroRNA-515-5p与VEGF关系

RSA组MicroRNA-146a-5p表达量与VEGF呈正相关(r=0.53,P<0.05)，MicroRNA-515-5p与VEGF呈负相关(r=-0.49,P<0.05)。

3 讨论

有80%的RSA患者在妊娠12周前发生流产，RSA给育龄女性带来极大身心痛苦。引起RSA的因素较多，除染色体异常、生殖器畸形、自身免疫性疾病、内分泌疾病外，还有50%的RSA原因不明[8-9]。积极探索RSA的可能机制，是临床治疗RSA的基础。

miRNA是一类长度较短的非编码RNA，被证实与多种疾病密切相关，其中也包括女性生殖性疾病。Zhao L等[6]研究发现，URSA患者蜕膜组织中Micr-146a-5p水平低于健康女性，Micr-146a-5p mRNA表达水平与IRAK1及TRAF6呈负相关，Micr-146a-5p可能通过增强IFN-γ活性导致胎盘免疫不耐受，进而导致流产。本研究发现，与健康妇女组相比，RSA患者绒毛组织内Micr-146a-5p mRNA及蛋白表达水平均降低，提示Micr-146a-5p可能参与了RSA发生。

MicroRNA-515-5p被证实与乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种癌变密切相关[10-12]。张荣枝[13]等研究发现，高表达的MicroRNA-515-5p能促进直肠癌细胞凋亡，降低细胞存活率。提示MicroRNA-515-5p可能参与了细胞的增殖和凋亡。RSA与滋养层细胞凋亡关系密切。本研究发现，RSA患者绒毛组织内MicroRNA-515-5pmRNA及蛋白表达水平高于对照组，说明MicroRNA-515-5p可能也参与了RSA发生。

血管生成是妊娠重要的生理机制，受精卵着床及胎盘循环建立均与生理机制密切相关。VEGF能促进内皮细胞增生与血管增生，增强血管通透性，改变细胞外基质[14]。有研究表明[15]，VEGF表达异常将造成胚胎血管生成障碍，最终导致血供不足，胚胎停止发育与自然流产。本研究发现，与对照组相比，RSA组患者绒毛组织内VEGF mRNA及蛋白表达量均明显下降。提示VEGF水平下降可能是引起RSA的一个原因。

此外，本文发现，RSA患者绒毛组织Micr-146a-5p与VEGF水平呈正相关，MicroRNA-515-5p水平与VEGF水平呈负相关。说明Micr-146a-5p水平降低、MicroRNA-515-5p水平升高，可能通过影响VEGF引起流产，共同参与RSA。但以上推论需进一步研究加以证实。

综上所述，RSA患者绒毛组织Micr-146a-5p表达下降，MicroRNA-515-5p表达上升，与VEGF表达存在相关性，推测Micr-146a-5p、MicroRNA-515-5p可能通过影响血管生成而引起流产，但具体作用机制需深入研究。