利用时差成像系统观察囊胚形成时间对临床结局的影响

熊平安 胡 雪 何 均 吴金华 张志军

湖北省十堰市太和医院(442000)

时差成像系统(TLI)是一种新型瞬间曝光连续拍摄的成像技术，同时与胚胎培养装置进行整合，与计算机分析软件相连构成全新的胚胎评估体系，确保观察过程中胚胎发育环境的稳定性[1]。其实时监控的特点可以对胚胎进行动态观察，并可利用形态动力学参数将胚胎发育过程进行量化，使其更加客观。文献证实，传统囊胚培养的第5天(D5)的囊胚与D6的囊胚移植后相比有更高的种植率与临床妊娠率[2-4]，囊胚的形成时间似乎与胚胎质量、临床结局相关[5-6]。为此，笔者通过TLI观察最优囊胚的形成的时间，比较不同时间组囊胚移植后临床结局，探讨囊胚的发育时间对临床结局的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2019年4月-2021年10月在本中心行TLI系统囊胚培养的313例为研究对象。纳入标准：①年龄<40岁；②囊胚形态学级别达到3BB及以上，③冻胚单胚胎移植。排除标准：①合并3～4期子宫内膜异位症及子宫腺肌并或(并)合并子宫腺肌瘤；②男方精液质量异常；③子宫内膜形态较差，且(或)合并输卵管炎性积水、宫腔粘连或子宫先天畸形；④有其他疾病影响胚胎种植，如甲状腺功能异常，免疫疾病未经治疗，如干燥综合征、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征等。⑤一方或者夫妻双方染色体异常；⑥ 既往体外受精(IVF)失败史。

1.2 研究方法

1.2.1促排卵患者均于月经第2～3日给予重组人促卵泡素(果纳芬，默克公司)100～300 U/d启动，促排卵4 d 后依据卵泡发育程度和性激素水平调整促性腺激素(Gn)用药，Gn第5天加用拮抗剂(思则凯，默克公司)每天0.25mg，直至扳机日。待卵泡直径≥1.8cm 达2个，或者≥1.7cm达3个，且卵泡直径>1.4 cm的个数>50%时，注射hCG 6500～10000U(艾泽0.25mg，默克公司)刺激卵母细胞成熟，36～38h后取卵，行TLI系统胚胎培养并记录囊胚形成时间，囊胚全部冷冻，择期行冻胚移植，移植后阴道给予地屈孕酮及黄体酮凝胶(雪诺同，默克公司)90 mg/d。移植12d后检测血hCG水平，如hCG>20U/L而宫腔未见孕囊，hCG逐渐下降为生化妊娠;移植28d后B超可见孕囊则证实为临床妊娠[7]。

1.2.2胚胎质量评估囊胚培养及评分根据视频图像结合Gardner囊胚评分系统[8]进行胚胎评分和选择。参照Gardner囊胚评分标准，囊胚扩张程度达到或高于3期(即3、4、5、6期)，内细胞团和滋养层细胞达到BB级及以上(包括AA、AB、BA、BB)的囊胚视为优质囊胚。

1.2.3胚胎分组最佳囊胚形成时间<120h视为短时组，120～144h视为中时组，>144h视为长时组。

1.2.4内膜准备囊胚冷冻1～2个月经周期后采用人工周期的方法准备内膜。内膜准备方法：月经来潮第2～3天检查性激素、甲状腺功能等无异常后，口服戊酸雌二醇(补佳乐)2次/d，3片/次，口服8d后检查子宫内膜，未达8mm者继续口服补佳乐，当内膜厚度>8mm时加用黄体酮针剂60mg转化内膜,5d后移植冷冻囊胚1枚。对于子宫内膜形态较差、子宫内膜回声不均者宫腔镜检查以及子宫内膜活检检查CD38、CD138,排除宫腔占位及慢性子宫内膜炎，对于存在慢性子宫内膜炎患者实施多西环素加甲硝唑规范治疗2周后，复查内膜病理免疫组化无异常后可纳入研究。

1.2.5胚胎移植及移植后用药移植后患者继续使用补佳乐2次/d，3片/次，黄体支持全部采用地屈孕酮片3次/d，1片/次，移植后黄体酮针剂改为阴道制剂的90mg(90mg/支，雪诺酮，默克公司)每日1支固定时间阴道塞用。移植后12d验孕，妊娠患者移植28d超声检查宫腔内孕囊。

1.2.6观察指标对于移植后12d hCG<20U/L的患者视为生化妊娠。发生异位妊娠者不纳入研究。主要观察指标为囊胚形成时间、临床妊娠率、种植率和流产率。临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数×100%；种植率=孕囊个数/总移植胚胎数×100%；早期流产率=流产例数/临床妊娠数×100%。临床妊娠率和着床率以胚胎移植后28d后通过超声检查探及宫内孕囊为标准。早期自然流产是指临床妊娠12周之前的妊娠丢失。本研究收集全部可能影响胚胎发育速度、种植率、临床妊娠率以及早期流产率的诸多因素。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料比较

3组对象年龄、BMI、不孕年限、Gn总量、转化日孕酮(P)及转化日内膜厚度均无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 一般资料的统计学比较

2.2 临床结局比较

3组早期流产率无差异(P>0.05)，而种植率及临床妊娠率有差异(P<0.05)；短时组与中时组分别与长时组比较种植率(χ2=8.693、5.106，P<0.05)、妊娠率有差异(χ2=20.214、5.106，P<0.05)。见表2。

表2 3组种植率、妊娠率及早期流产率比较[%(例)]

3 讨论

因未见有文献报道抗苗勒氏管激素(AMH)、基础卵泡个数、获卵个数等指标与卵母细胞质量存在相关性，故本研究中未纳入患者的这些指标。且文献报道使用延时成像生成的KID(Key Index)评分评估胚胎质量时，血清AMH与胚胎质量之间无显著相关[9]。

目前有较多文献证实拮抗剂方案新鲜周期移植妊娠率低于冻胚移植妊娠率，可能与子宫内膜受应用拮抗剂的影响，子宫内膜容受性下降有关[10]。因此本研究选择冻胚移植周期，患者在囊胚冷冻1～2个月后采用人工周期的方法准备内膜，当内膜厚度>8mm时加用黄体酮针剂60mg转化内膜后移植冷冻的囊胚1枚。传统的囊胚培养对胚胎的监测时间一般设定为120h及144h左右进行观测，受限于样本例数的影响，本研究将囊胚的形成时间分为<120h短时组，120～144h的中时组，>144h长时组。

本研究中均实施单胚胎移植，种植率与妊娠率几乎相似，短时组出现1例单卵双孕囊患者。大量文献证实传统的单囊胚D5移植较D6移植妊娠率更高，反映囊胚的形成速度会影响胚胎的种植率及妊娠率。本研究显示短时组、中时组与长时组种植率、临床妊娠率相比差异显著(P<0.05)；而短时组与中时组种植率与临床妊娠率无差异(P>0.05)。由于本研究样本例数有限，以及可能存在不可控因素的影响，有待于进一步大样本数据证实，或者进一步将囊胚形成时间细分比较各组间是否存在差异；3组早期流产率无差异(P>0.05)。胚胎流产的原因较复杂，胚胎染色体结构及数目的异常以及基因片段的丢失、重复等等只是流产因素的原因之一，因此本研究结果不能显示囊胚形成时间对流产因素的影响。

综上所述，利用TLI培养系统分析胚胎囊胚形成时间可作为挑选胚胎的参数进行胚胎移植，从而提高临床妊娠率具有可行性。