碳纳米管作为载体在生物医学中的研究进展

杨 敏，张 瑜，朱效博，王 涛，宋翠平，杨智和，李木子，王桂琴，赵思俊

（1.宁夏大学，宁夏银川 750021；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山西农业大学，山西晋中 030800；4.青岛市智慧乡村发展服务中心，山东青岛 266200；5.天津农学院，天津 300384）

细胞对蛋白质和核酸等外来物质渗透性较差，使这些生物分子不易穿越细胞膜进入细胞。因此有必要寻求可在细胞内运输生物分子（如DNA、蛋白质、药物等）的新型载体，以便有效突破细胞膜屏障，运送和使用细胞外的药物并使其发挥功能[1-3]。目前诸多药物载体的出现降低或避免了药物在单独使用过程中存在的组织分布差、溶解率低、选择性缺乏等不足[4-5]。随着人们对纳米技术的深入探索，各种纳米材料已被广泛应用于生物医学领域中。其中，具有特殊性能的碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）能有效跨越生物屏障，穿透多种细胞[6-7]。与传统药物载体相比，CNTs 具有体积小、比表面积高、可功能化、细胞穿透能力强，以及可与更多的生物大分子和药物结合的特点，成为一类新型载体，使其在蛋白质、基因和药物的传递方面具有广阔的应用前景[8-9]。

1 CNTs 的分类

CNTs 可分为单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）[10]。SWCNTs 由单个石墨烯组成，直径通常为0.4～3.0 nm，长度通常为20～1 000 nm；MWCNTs 由多层石墨烯组成，直径通常为1.4～100.0 nm，长度通常为1～50 μm。CNTs 的每个碳原子以sp2键结合，比金刚石中的sp3键更强，使得CNTs 具有独特的物理化学性质，如表面易修饰、能进入细胞、生物相容性好、非免疫原性等[11-12]。

2 CNTs 进入细胞的方式

通常认为CNTs 进入细胞有内吞作用和被动扩散两种方式。内吞作用是细胞膜依靠能量吞噬细胞外物质，可进一步分为胞饮作用、吞噬作用和网格蛋白介导作用[13-14]；被动扩散是CNTs 直接渗透到细胞质，通常是指CNTs 与脂膜的亲脂作用，从而发生内化[15]。Zhu 等[16]将酿酒酵母细胞加入到4 ℃条件下氧化的SWCNTs 悬液中，使用拉曼分光光度计定量测定酿酒酵母中氧化的SWCNTs，并用实时聚合酶链反应（real-time PCR）检测细胞内吞的相关基因，结果发现氧化的SWCNTs 可通过内吞作用进入酿酒酵母细胞，并分布到细胞质、囊泡、溶酶体和细胞核中。Porter 等[17]将细胞与SWCNTs 溶液混合2 d 后发现，大多数SWCNTs位于细胞的吞噬小体和溶酶体内，体现了SWCNTs的吞噬作用；第4 天，可观察到SWCNTs 通过细胞膜转移到邻近的细胞质中，表明此过程是脂质双分子层的被动摄取。因此，SWCNTs 进入细胞可能同时存在内吞作用和被动扩散两种方式。Dumortier 等[18]通过氧化/酰胺化处理和1,3-偶极环加成反应制备了两种类型功能化CNTs，研究发现经过功能化的CNTs 在体外均可被B 淋巴细胞、T 淋巴细胞以及巨噬细胞摄取，并且通过氧化/酰胺化处理的CNTs 可形成稳定的水悬浮液。

3 CNTs 的功能化

CNTs 难溶于多数溶剂，且因π-π 共轭、疏水力、范德华力等作用，分散性较弱，极易在溶液中形成团聚现象。CNTs 的特殊性能可被各种化学物质功能化和修饰[19]。功能化使CNTs 表面性质发生了改变，增加了其分散性、均匀性和溶解性。因此，CNTs 的功能化使其在生物医学中的应用更加广泛，通过在CNTs 的侧壁和末端引入不同基团，可将多肽、蛋白质、核酸以及药物等生物分子通过共价或非共价作用偶联到CNTs 上[20]，从而可以靶向病灶部位的组织、器官，达到治疗疾病的目的[21]。根据功能化的分类可分为共价功能化和非共价功能化。

3.1 共价功能化

共价功能化通过改变CNTs 的结构，使碳杂化从sp2变为sp3，从而改变CNTs 的特性，使CNTs具备负载药物及生物分子的能力。共价功能化最常见的方法是通过强酸氧化处理CNTs，在其表面生成羧基基团。尽管共价功能化破坏了CNTs 的π-π共轭，但其氧化为氨、凝集素和氨基酸等进一步修饰提供了机会[22]。CNTs 表面的羧基在与亚硫酰氯反应之后，对加入含有游离氨基团的化合物进行修饰[23]；通过共价修饰，可以制备不同烷基链或末端官能团，生成不同的CNTs 复合物，从而增强CNTs 的生物相容性和靶向附着生物分子的潜力及其在生物医学中的应用[24]。

3.2 非共价功能化

CNTs 的非共价功能化是基于π-π 共轭、氢键、静电、范德华力和疏水作用等不同的作用方式[25]，通过表面活性剂、芳香族化合物、聚合物等进行非共价功能化。此方法不会对CNTs 的独特结构造成破坏，并保留了CNTs 的物理、光学、热和电性能等原有性质[26]，同时也保留了CNTs 的sp2杂化六元环和扩展偶联。

4 CNTs 作为载体的应用

CNTs 特殊的性能和独特的结构，可共价键合不同种类的化学基团，也可非共价偶联多种生物大分子。同时，CNTs 具有良好的细胞穿透性，作为载体时，在增加药物负载率、提高药物疗效方面显示出潜在的应用价值[27]。

4.1 CNTs 作为蛋白质载体

Zhao 等[28]研究比较了3 种不同直径MWCNTs 吸附牛血清蛋白的特征，发现直径小于10 nm 的MWCNTs 相比直径为10～20 nm 和20～40 nm的能吸附更多牛血清蛋白。周霜[29]发现：CNTs可与肌红蛋白发生较强的作用，通过改变肌红蛋白的二级结构，使其主肽链发生去折叠或者重排；血液中的蛋白质也可通过非共价相互作用与CNTs结合形成蛋白质冠，从而影响CNTs 和血液的生物相容性。Lu 等[30]研究了3 种长度为1～3 μm，直径为1～2 nm，含不同官能团的CNTs 对人血清白蛋白的吸附作用，发现羧基化SWCNTs 对人血清白蛋白的吸附率远高于羟基化SWCNTs 和氨基化SWCNTs 对人血清白蛋白的吸附率。随后，Lu 等[31]又比较了人免疫球蛋白G、人血清白蛋白和纤维蛋白原与长度为1～3 μm，直径为1～2 nm的SWCNTs 的结合能力，结果发现纤维蛋白原与SWCNTs 的吸附量最高，且仅用人免疫球蛋白G与SWCNTs 结合就会刺激中性粒细胞中髓过氧化物酶的释放。Nicoletti 等[32]研究表明：羧基或氨基功能化的MWCNTs 可以与免疫球蛋白等高丰度蛋白以及载脂蛋白、补体成分等低丰度蛋白形成蛋白冠；经聚乙二醇功能化的MWCNTs 也可与人血浆蛋白形成蛋白冠[33]。以上研究均表明，CNTs 可与蛋白质发生作用。

4.2 CNTs 作为基因载体

基因传递到细胞的方法可分为两种：病毒基因载体和非病毒基因载体。病毒基因载体是病毒携带基因进入细胞，此法可高效递送基因，使基因高水平表达，但是会造成机体产生炎症反应和免疫原性；非病毒基因载体是通过物理和化学方法使目的基因进入细胞[15]。Nahle 等[34]将NR8383 大鼠肺泡巨噬细胞作为体外模型研究后发现：经氨基或羧基功能化的MWCNTs 可改变哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，从而增加Lamtor（晚期溶酶体和核内体接头蛋白）编码基因的表达；此外，氨基功能化的MWCNTs可激活转录因子EB并诱导自噬，羧基功能化的MWCNTs 可改变真核翻译起始因子4 和磷酸蛋白70 核糖体蛋白S6 激酶信号通路，并上调Toll 样受体2 基因的表达。Edwards 等[35]研究发现，经聚酰胺-胺型树枝状功能化的CNTs 能有效传递双链核糖核酸（double stranded RNA，dsRNA）、聚酰胺-胺型树枝状-CNTs-dsRNA复合物，使其快速进入靶细胞，并诱导产生比单独使用dsRNA 更强的效果。Munk[36]等将羧基化MWCNTs 与质粒DNA 以5:1（质量比）的比例混合，涡动孵育形成羧基化MWCNTs-质粒DNA 复合物，然后将含绿色荧光蛋白基因的质粒DNA 导入成纤维细胞，利用流式细胞仪、荧光成像和realtime PCR 分析，证明羧基化MWCNTs 可将质粒DNA 传递到牛原代成纤维细胞。开放阅读框149（open reading frame149，ORF149）基因是编码锦鲤疱疹病毒（koi herpes virus，KHV）的主要免疫原性蛋白之一。Hu 等[37]构建了重组质粒pcDNAORF149，制备了SWCNTs-pcDNA-ORF149 复合物，用于制作KHV 疫苗，结果发现相同剂量下，注射SWCNT-pcDNA-ORF149 疫苗的抗体含量远高于只注射pcDNA-ORF149 的抗体含量，免疫效果提高了33.9%。SWCNTs-pcDNA-ORF149 疫苗不但可诱导锦鲤产生血清抗体，而且还提高了酶活性和免疫相关基因表达水平，并提出肌肉注射10 μg SWCNTs-pcDNA-ORF149 对锦鲤抵抗KHV 的免疫效果最佳。Munk 等[38]将MWCNTs 与质粒DNA偶联，形成MWCNTs-质粒DNA 复合物，用于体外受精牛胚胎的转染，发现MWCNTs-质粒DNA可穿过透明带，进入胚胎中，且不会改变胚胎中的基因水平表达。以上研究均表明，CNTs可作为载体，提高基因的表达水平。

4.3 CNTs 作为抗癌药物载体

CNTs 比表面积高，可以很容易结合各种药物进行药物传递，达到理想的治疗效果。Salastreviño 等[39]设计了一种透明质酸与氧化MWCNTs的复合物作为载体，结合药物卡铂用于体外模型肺癌的治疗，初步研究表明氧化MWCNTs-透明质酸-卡铂复合物具有良好的体外特异性抗癌作用。Jawahar 等[40]将纯化的CNTs 与聚乙二醇、叶酸溶液一起超声，形成叶酸-聚乙二醇-CNTs的复合物，然后将盐酸雷洛昔芬通过疏水作用与叶酸-聚乙二醇-CNTs 结合，结果发现叶酸-聚乙二醇-CNTs有助于提高盐酸雷洛昔芬的载药率，载药率为74.2%±4.67%，因而可提高乳腺癌的治疗疗效，还能作为活性靶向配体靶向癌细胞。Li 等[41]制备了一种CNTs（Fe）/羟基磷灰石的复合物，再用壳聚糖和叶酸对所合成的CNTs（Fe）/羟基磷灰石复合物进行化学修饰，制备了一种新型磁性靶向药物载体，发现叶酸-壳聚糖-CNTs（Fe）/羟基磷灰石复合物对多西环素的平均载药率可达130%，并且铁磁性可以使载体在磁场下传递药物，从而实现药物的靶向作用。Jagusiak 等[42]制备了SWCNTs 与刚果红的复合物，然后将多西环素偶联到SWCNTs-刚果红的复合物上，结果发现SWCNTs-刚果红大大增加了多西环素的载药率，与药物结合的高能力可能会降低体内药物载体复合物的排泄率，延长药物在靶位点的作用时间。Tavakolifard 等[43]用紫杉醇、叶酸对SWCNTs 进行功能化，形成了紫杉醇-叶酸-SWCNTs 的复合物，通过傅里叶红外光谱、紫外可见吸收光谱等方法检测都证明叶酸和紫杉醇已成功加载到SWCNTs 上。Rathod 等[44]通过使用乙二胺和苯基硼酸基团对CNTs 表面进行双官能团化，形成了乙二胺-苯基硼酸-CNTs 的复合物，然后在功能化后的CNTs 上加入紫杉醇，结果发现紫杉醇通过π-π 相互作用偶联到CNTs 上，且载药率可高达30.85%。Comparetti 等[45]也研究发现，CNTs 是紫杉醇治疗癌细胞的有效载体，并将抗前列腺特异性膜抗原的抗体和负载紫杉醇的CNTs 分别作用于前列腺癌细胞和结肠癌细胞，结果发现抗前列腺特异性膜抗原的抗体可增强CNTs-紫杉醇药物的疗效和对前列腺癌细胞的杀伤作用，但对结肠癌细胞的杀伤效果不明显，展示了该方法的特异性。以上研究均表明，CNTs 可作为载体，增加药物的载药率并提高药物疗效。

5 小结和展望

本文综述了CNTs 功能化的方法和其穿透细胞的优异能力，及其作为载体在蛋白质、基因和抗癌药物等方面的研究进展。近年来，越来越多的研究团队探索了将生物分子偶联到CNTs 的各种方法，在这过程中，如果能更好地通过功能化提高CNTs在溶液中的分散性、稳定性，增强组织相容性，以最大限度地提高其与生物分子的偶联率和活性，这将进一步实现CNTs 的有效利用。