山东省青岛市猫病毒性鼻气管炎流行情况调查

孙厚民，李陆梅，祝洪伟，陈玉霞，孙 鹏，楚电峰，范根成

（青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266100）

猫病毒性鼻气管炎（feline viral rhinotracheitis，FVR）是由猫疱疹病毒Ⅰ型（feline herpesvirus-1，FHV-1）引起猫的一种急性、高度接触性上呼吸道疾病，以打喷嚏、流泪以及结膜炎和鼻炎为主要临床特征[1]，主要侵害幼猫，引起的发病率达100%，死亡率约为50%，对成年猫的病死率达20%～30%，是目前已知的重要猫呼吸道疾病之一[2]。FHV-1 是疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科水痘病毒属成员，具有疱疹病毒的一般特性，病毒粒子直径为126～167 nm，病毒粒子中心致密，外有囊膜，为双股DNA 病毒，基因组大小为126～134 kb，立体对称的核衣壳上分布有162 个壳粒[3]。FHV-1 于1958 年首次在美国被分离到[4]，现在世界范围内广泛流行[5-10]。为了解山东省青岛市FVR 的流行情况，开展了FHV-1 感染情况筛查，并对筛查结果进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本信息 218 份猫拭子样本编号为1～218号，来源于青岛市市区及所辖的胶州市、平度市和莱西市，其中1～80 号在宠物猫主人家里采集，81～154 号采集于宠物医院，155～194 号采集于宠物市场，195～218 号采集于宠物救助站；60 份猫血清样本编号为1～60 号，其中1～40 号来源于宠物医院，41～60 号来源于宠物救助站。

1.1.2 主要试剂及仪器 FHV-1 毒株和猫肾传代细胞（F81），由动物基因工程疫苗国家重点实验室提供；DMEM 培养基和胰酶，均购自Hyclone公司；DNA 快速提取试剂盒，购自杭州博日科技股份有限公司；离心机，购自德国Sigma 公司；PremixTaq及2 000 bp DNA Marker，均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；PCR 仪，购自德国Biometra 公司；核酸琼脂糖凝胶电泳仪，购自北京市六一仪器厂；凝胶成像分析仪，购自美国Bio-RAD 公司；倒置生物显微镜，购自徕卡显微系统（上海）有限公司；CO2培养箱，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与处理

1.2.1.1 拭子样本 用无菌棉拭子采集被检猫眼鼻拭子，将拭子悬浮于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，漩涡振荡1 min，除菌过滤后，取200 μL 按DNA提取试剂盒说明书提取DNA，将处理后的DNA样品直接使用或于-70 ℃冰箱中保存备用。

1.2.1.2 血清样本 前肢静脉采血1～2 mL，37 ℃放置1 h，4 ℃放置30 min 凝固后，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清直接使用或于-40 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 拭子样本检测

1.2.2.1 基因扩增 利用针对FHV-1gD基因建立的PCR 方法，对样本进行基因序列检测。检测用上游引物FHV（gD）-F：atgatgacacgtctacattt；下游引物FHV（gD）-R：ttaaggatggtgagttgtat。扩增片段大小为1 125 bp。反应体系组成（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，提取的DNA 样本2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，35 个循环；72 ℃最终延伸5 min。

1.2.2.2 PCR 产物检测 取10 μL 扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL EB）进行电泳鉴定。电泳缓冲液为1×TAE，130 V 电泳25 min，在凝胶成像分析仪下观察PCR 产物条带在凝胶中的位置，以2 000 bp DNA Marker 为参照物，判定结果。将PCR 阳性扩增片段进行测序，然后与GenBank中FHV-1 序列进行比对[11]。

1.2.2.3 阳性样本复测 将所有PCR 检测为阳性的样本进行复测，复测仍为阳性的样本判为阳性。

1.2.3 TCID50测定 将FHV-1 病毒液用含2%FBS 的DMEM 进行10 倍倍比稀释，共稀释12 个梯度，取长满单层F81 细胞的96 孔细胞培养板，倒出生长液，将稀释好的病毒液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每个稀释度重复5 个孔；轻微摇动混匀后于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每日显微镜下进行细胞病变（CPE）观察，连续观察5 d；出现CPE 的孔记为“+”，未出现的记为“-”，按照Reed-Muench 法[12]计算该病毒悬液的TCID50。

1.2.4 血清样品中和抗体效价测定 根据测定的TCID50值，将FHV-1 病毒液稀释成2 00 个TCID50/0.1 mL；将待测血清样品56 ℃灭活30 min，然后用含2% FBS 的DMEM 作2 倍倍比稀释至1:1 024；吸取各稀释度血清500 μL 加入到1.5 mL 离心管中，同时加入500 μL 已稀释好的FHV-1 病毒液，轻轻摇晃混合后于37 ℃孵育1 h；取长满单层F81 细胞的96 孔细胞培养板，倒出生长液，将血清病毒混合液加入到96 孔板中，每孔100 μL，每个稀释度重复5 个孔，同时设置阴性血清对照、病毒对照和正常细胞对照；于37 ℃、5%CO2培养箱中培养3 d，显微镜下观察CPE。按照Reed-Muench法，计算待测血清样品的中和抗体效价。

1.2.5 检测结果分析 统计所有被调查猫的病毒携带率，对不同来源、年龄和性别猫的检测结果，采用SPSS 26.0 软件进行数据分析，比较组间差异，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义；以中和抗体效价大于1:8 为阳性，等于1:8为可疑，小于1:8 为阴性[13]，统计不同来源血清样本的抗体阳性率。

2 结果

2.1 PCR 检测 电泳结果（图1）显示，218 份猫样本中有22 份样本扩增到约1 125 bp 的阳性目的条带，对该22 份样品进行复检，仍均为FHV-1阳性，阳性率为10.1%（22/218）。

2.2 不同来源猫样品检测结果统计

22 份FHV-1 阳性样品中，来自宠物救助站的4 份，阳性率为16.7%，检出率最高，来自宠物猫主人家的6 份，检出率为7.5%，但各组间均无显著性差异（P＞0.05）。具体结果见表1。

表1 不同来源样品的FHV-1 检测结果

2.3 不同年龄和性别猫样品检测结果统计

从年龄来看，2～6 月龄幼猫的FHV-1 阳性率为13.6%，略高于成年猫（7.0%），但两组间无显著性差异（P＞0.05）；从性别来看，成年公猫阳性率（7.3%）稍高于成年母猫（6.7%），两者亦无显著性差异（P＞0.05）。详见表2。

表2 不同性别和年龄猫的FHV-1 检测结果

2.4 血清样品抗体检测结果统计 按照1.2.3 的方法计算出病毒悬液的TCID50为10-6.5/0.1 mL。在40份宠物医院提供的血清样本中，检出阳性26 份，检出率为65.0%（26/40）。20 份宠物救助站提供的血清样本中，检出阳性14 份，检出率为70.0%（14/20）。血清中和抗体效价检测详见表3～4。

表3 宠物医院40 份血清中和抗体检测结果

表4 宠物救助站20 份血清中和抗体检测结果

3 讨论

Gourkow 等[14]在2013 年对加拿大西部一家动物收容所的250 只患有上呼吸道感染的流浪猫进行了FHV-1 qPCR 检测，发现不高于3%的猫感染了FHV-1。2017 年Fernandez 等[15]对从西班牙多家动物医院收集的358 只出现结膜炎和上呼吸道疾病的家养猫眼鼻口拭子进行了qPCR 检测，结果FHV-1 阳性检出率为15.1%。Nguyen 等[16]2019 年对从澳大利亚多家动物医院收集的3 142 只出现上呼吸道疾病的家猫进行了PCR 检测，结果FHV-1阳性检出率为7%。FHV-1 呈间歇性排毒，多数情况下潜伏在三叉神经节，因此PCR 检测结果与感染时间及排毒情况有关，呈一过性。本调查结果显示，青岛市FHV-1 的PCR 检测阳性率为10.1%，宠物救助站猫的阳性率（16.7%）略高于其他来源猫，可能与来源复杂有关。2～6 月龄幼猫的FHV-1阳性检出率较高，可能因其断奶后失去母源抗体保护，而自身免疫系统尚未发育健全，所以应加强对断奶后幼猫的相关免疫。

2012 年Digangi 等[17]对进入佛罗里达动物收容所的猫，针对FHV-1 的血清抗体滴度进行了流行率调查，结果发现347 只猫的血清阳性率为11.0%。2019 年Paola 等[18]对意大利米兰流浪猫中抗疱疹病毒的血清抗体滴度进行了流行率调查，结果发现该地区流浪猫中抗疱疹病毒的血清阳性率为37.1%。本研究采用的中和抗体检测方法，是抗体检测的经典方法，也是“金标准”方法，既能定性也能准确定量。检测结果显示，宠物医院接诊猫的FHV-1 中和抗体阳性率为65.0%，虽然部分猫的抗体效价达到1:512，但抗体整齐度很差，且有35.0%猫的抗体滴度达不到最低保护标准，存在感染发病风险。跟踪调查这40 份宠物医院接诊猫的免疫背景，有32 只猫免疫过FHV-1 疫苗，但有12只抗体呈阴性，表明抗体保护水平不高，因此应加强对宠物猫的免疫。宠物猫免疫FHV-1 疫苗后，有必要进行中和抗体效价测定，中和抗体效价不合格的需要补免。救助站收容猫的FHV-1 中和抗体阳性率高达70%，但抗体效价均较低，仅能达到1:16，有些可能是临床发病康复后产生的抗体，然而救助站收容猫的抗原、抗体阳性率均较高，说明救助站收容猫的FHV-1 感染率很高，所以应加强对救助站收容猫的相关免疫。

本研究的采样范围和样本数量有限，调查样本基本来自宠物医院、宠物救助站、宠物猫主人家和宠物市场，缺乏城市流浪猫、郊区野猫和林区山猫等不同背景的数据，这些问题有待于在更长时间段、更大范围的数据收集基础上进行探讨，以便得出更加客观真实的结果。FVR 作为猫的常见病，严重影响猫科动物生活质量，甚至有致死风险，然而目前尚无特效疗法，仅以预防为主。国内现有疫苗数量很少，应尽快研制国产FHV-1 相关疫苗，以解决疫苗短缺及免疫失败问题，更好地防控FHV-1 相关疾病。