非洲猪瘟疫苗研制方向及进展

张振兴，曾 毅，宋建领

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；2.水富市两碗镇人民政府，云南水富 657803）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种生猪接触性传染病，急性死亡率能达到100%[1]。ASFV 隶属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，而且是该科属的唯一成员，作为一种大型囊膜DNA 病毒，拥有异常庞大的双链DNA 基因组，总长度170～190 kb[2]。此外，ASFV 具有上百个能编码完成多肽链的开放阅读框（open reading frames，ORF），不仅能编码150 多种非结构蛋白和结构蛋白，甚至还能编码免疫调节蛋白，调节先天免疫及细胞凋零等信号通路。截至目前，ASFV仍有几十种蛋白质未被鉴定分析出来[3]。

1921 年ASF 首次暴发于非洲东部的肯尼亚，此后的30 多年间ASFV 一直在非洲范围内传播和蔓延，1957 年后相继传播到欧洲、美洲。直到20世纪90 年代中后期，除意大利撒丁岛地区以外，欧洲其他地区以及美洲地区才消除了ASFV 的感染和侵袭[4]。2007 年，ASFV 蔓延到高加索地区的格鲁尼亚等国家，此后迅速传播到俄罗斯及东欧一些国家。2018 年8 月，ASFV 首次在我国辽宁省沈阳市被发现[5]，到2019 年底全国共报告发生ASF疫情162 起，扑杀生猪120 万余头[5]。至今，ASF疫情在我国仍呈散发态势，并且我国周边国家包括老挝、蒙古国、越南、朝鲜、柬埔寨等[6-8]也报道发生ASF 疫情。ASFV 已经呈现出全球蔓延的趋势，给各国生猪养殖者造成了严重的损失。因此，国内外科研人员从多个方向致力于研发可以有效利用的ASFV 疫苗来应对ASF 疫情。本文对不同研制方向的研究进展情况及难点进行综述，以期对ASF疫苗研发提供参考。

1 灭活疫苗

灭活疫苗作为ASFV 疫苗研制的首选策略，其原理是通过加热或者加入相应的化学试剂等物理/化学方法，将人工培养的ASFV 杀死，使ASFV丧失原本应有的感染能力和毒性，而只保留免疫原性，灭活后再结合相应的非特异性免疫增强剂（佐剂）制成疫苗。ASFV 灭活疫苗虽然有价格低廉、制备工艺相比其他方式更加简单便捷的优势，但是因为其在化学灭活或者物理灭活的过程中会丧失ASFV 本身应有的感染力，只能引起生猪免疫应答中的体液免疫，而无法引起细胞免疫，导致在生猪体内产生的免疫应答非常弱或者无法持久，更不能有效地对中和抗体产生诱导作用，从而导致灭活疫苗无法对生猪产生根本性的保护作用。研究人员将ASFV 感染后的猪肺泡巨噬细胞分成两组分别进行戊二醛浸泡处理和洗涤剂浸泡处理，并将处理后的细胞再次注射入感染ASFV 的患病猪体内进行观察，但是免疫保护效果不甚理想[5]；随着新技术的研发，也有通过其他方法，如通过进一步纯化灭活病毒粒子，对ASFV 进行灭活加工处理，但是效果均不理想[9]；只有2014 年，Sandra 等[10]发表的论文指出，在灭活ASFV 得到的试剂中加入PolygenTM等佐剂，注入猪体内后可应答产生参与ASFV 内化的p30 等特异性抗体，但遗憾的是加入佐剂的方法仍未诱导生猪产生根本有效的细胞免疫应答。截至目前仍未发现ASFV 灭活疫苗研发获得实质性进展的报道，这可能与ASFV 复杂的免疫逃逸机制和成熟方式有关。

2 减毒活疫苗

ASFV 减毒活疫苗的研制分为两种：一是ASFV 自然致弱活疫苗的研制，二是ASFV 重组致弱活疫苗（基因工程减毒活疫苗）的研制。其原理是经过各种处理，让ASFV 发生变异，使其既降低自身原有的毒性，又保留其免疫原性。二者的区别在于，ASFV 自然致弱活疫苗的研制是通过常规途径，如细胞传代培养、非宿主动物连续传代等方式获得致弱的毒株；ASFV 重组致弱活疫苗（基因工程减毒活疫苗）的研制是通过寻找和定位ASFV中与病毒毒力相关以及引起宿主应答的基因，如ASFV 中的NL、TK、9GL、MCF 360/55等基因，把其敲除后再经过一系列操作获得的基因缺失弱毒株。ASFV 减毒活疫苗的研制优势很多，它既能诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫；在生猪体内起到长时间的免疫应答作用；可以在猪场生猪群中水平传播，使生猪群体获得良好的免疫屏障等。通过总结前人研究，对二者进行比较发现，ASFV 重组致弱活疫苗（基因工程减毒活疫苗）的研制前景要好于ASFV 自然致弱活疫苗。Leitão 等[11]通过猪骨髓细胞传代培养获得的天然减毒株NH/P68免疫猪群后，经测试发现其对亲代毒株的免疫保护率最高可达100%，但是对不同基因型ASFV 的交叉保护率不甚理想，有的只有66%，而且对猪群会产生一定的毒副作用，甚至有毒力返强的征象。Monteagudo 等[12]将ASFV 基因Ⅰ型的CD2V/ER402R基因敲除后获得的ASFV 基因Ⅰ型Ba71 弱毒株免疫猪群后，不仅能够对亲代毒株产生良好的免疫应答反应，还能对不同基因型的ASFV，如ASFV 基因Ⅰ型E75、ASFV 基因Ⅱ型Georgia07 等ASFV 强毒株产生良好的免疫应答反应。这种交叉保护反应是ASFV 自然致弱活疫苗所不能比拟的。

目前较有希望研制成功的ASFV 重组致弱活疫苗，是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所以我国流行的ASFV 基因Ⅱ型HLJ/18 毒株为亲本构建的7 基因缺失重组疫苗，其在猪群中的动物试验显示，可以在猪群中做到100%减毒，而不会诱使产生ASFV 强毒株，同时能对目前存在的致死性ASFV 起到较高的保护作用[13]。此外，我国军事医学科学院军事兽医研究所扈荣良教授团队以我国流行ASF 毒株SY18 为亲本成功构建了能100%抵抗亲本毒株攻击的MGF和CD2v双基因缺失株[14]，这也能证明ASFV 疫苗研究成功的方向或许在于ASFV 重组致弱活疫苗。

3 亚单位疫苗

ASFV 亚单位疫苗也被称为ASFV 组分疫苗，即利用ASFV 上某种表面结构成分，通过合成加工（化学分解、选择性控制水解相关蛋白等方式），提取ASFV 特定的蛋白质结构，通过筛选获得具有免疫原性的蛋白组分，研制成的一种本身不含有ASFV 核酸，但却能诱发生猪产生免疫保护的一种疫苗。ASFV 亚单位疫苗和ASFV 重组致弱活疫苗一样，也是利用基因工程方式，只是选取的基因相对会小很多，因而具有更高的生物安全性，但面临的问题也有很多，如只能提供部分免疫保护、交叉保护效率低、无法产生中和抗体等。与ASFV内化相关的蛋白p30，作为ASFV 最具有抗原性结构蛋白之一，目前被广泛应用于各实验室的ASFV血清学检测中。但是单独作为ASFV 亚单位疫苗的研究对象，即使可以在免疫猪群中产生中和抗体，也无力抵御ASFV 强毒株的攻击，还可能造成免疫猪群出现强烈的病毒血症甚至死亡；单独利用在ASFV 附着中发挥重要作用的p54 蛋白研制ASFV亚单位疫苗，也遇到与p30 类似的问题，免疫保护率基本为0[15]。相关试验结果见表1。

4 DNA 疫苗

DNA 疫苗又被称为核酸疫苗，是指将编码ASFV 特异性蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到生猪体内，使编码后的ASFV 蛋白质抗原基因能够在生猪体内表达并使生猪产生体液免疫和细胞免疫应答，从而对生猪起到免疫保护作用。目前DNA 疫苗已经被广泛应用到防控猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟等多种生猪病毒性疾病当中，具有可消除疫苗毒性、能同时诱导产生细胞免疫和体液免疫、保存制作更加适应需求等特点，也被称为第三代疫苗（前两代疫苗按时间顺序是灭活疫苗、减毒活疫苗）。但是在研制ASFV DNA 疫苗中，也同样遇到不少问题和难点，比如使用p54/p30 作为靶抗原制作的DNA 疫苗在生猪体内无法产生中和抗体，也不能诱导产生细胞免疫[18]，p54/p30/sHA 融合制成的DNA 疫苗对生猪的保护效率几乎为0[19]。

5 病毒载体疫苗

病毒载体疫苗是使用病毒载体诱导特异性免疫及非特异性免疫的疫苗，是通过去除或使用免疫原替换病毒毒力基因，或使病毒载体无法复制来保障疫苗安全性的一种手段。但是迄今为止，对研制ASFV 载体疫苗的相关文献甚少，而且均缺少对ASFV 强毒株攻击的免疫评价和动物性试验，因而需要对其进行进一步探究和分析[5]。

6 结语

ASFV 疫苗研制至今已经有长达几十年的历史，但是由于ASFV 具有比寻常病毒更加巨大的基因组、多达24 种的基因型、迅速的变异能力、复杂多变的免疫逃逸机制等特点，现在仍然没有研制成功可以在生猪体内能起到有效作用的疫苗。灭活疫苗相对安全，但是提供的保护力偏低；DNA疫苗还无法诱导产生细胞和体液免疫应答；病毒载体疫苗需要精准定位ASFV 免疫原基因；减毒活疫苗可以提供同源保护，是目前比较理想的ASFV疫苗研制途径，但是存在较大的生物安全隐患。ASFV 疫苗的研制仍然需要加深对ASFV 致病机理的研究，准确定位致病基因，努力探索ASFV 疫苗与宿主细胞的相互作用机理，同时要加强国内外生物安全性级别高的实验室的合作研究，只有这样才能加快ASFV 疫苗研制成功的步伐。