吕士红 王长杰 朱洪春 杨白婧
牡丹江医学院附属第二医院消化内科,黑龙江牡丹江 157000
胶质细胞包括星形胶质细胞、无突胶质细胞、少突胶质细胞,对神经元有支持和引导迁移的作用,在神经系统的修复中发挥重要的作用,参与髓鞘的形成,参与血脑屏障。发生在神经外胚层的胶质瘤是神经系统常见的肿瘤,起源于神经间质细胞,恶性胶质瘤的五年生存率低,平均生存期短[1]。延长患者的生存期,提高患者生活质量是科研和医疗工作者的急迫任务。细胞骨架的功能包括维持细胞形态、保持内部细胞结构有序性、基因表达、细胞分化,微丝是细胞骨架的主要成分之一[2]。微丝解聚因子(cofilin)是肌动蛋白结合蛋白,调节微丝骨架重建,影响其细胞增殖、迁移、凋亡等功能[3-4]。本研究分析cofilin 对胶质瘤迁移和浸润的影响。现报道如下。
胶质母细胞瘤干细胞(GSC)株来自牡丹江医学院实验室,包括基因沉默GSC 细胞(对照组)与过表达cofilin 的GSC 细胞(观察组)。细胞培养液(赛默飞),10%胎牛血清,细胞培养箱(博科集团),荧光显微镜(奥林巴斯)。Tracking Tool PRO v2.1 软件,Transwell 实验板。
1.2.1 细胞培养 10% 胎牛血清,细胞培养液DMEM,37℃,5%CO2浓度的细胞培养箱内培养,每2~3 d 细胞传代一次。
1.2.2 划痕实验[5]将所用的器械消毒灭菌。在6 孔板上使用记号笔过孔均匀划线,间隔1 cm。在6 孔板中接种对数生长期细胞,待细胞完全生长融合,再进行划痕实验。用移液器洗头垂直划线用力均匀匀速划痕,用PBS 液洗涤。将细胞在培养基中培养48 h,分别于0、12 以及48 h,用显微镜拍摄细胞图片。用Image J 软件测量细胞的测量距离。迁移速率=(0 时的伤口宽度-观察时点的伤口宽度)/0 h 时伤口宽度×100%,评价cofilin 对胶质瘤细胞迁移的影响。
1.2.3 浸润实验[5]制备Transwell 小室,下室加入含10%胎牛血清的培养液600 μl。取对数生长的细胞0.25%的胰蛋白酶消化,PBS 清洗3 次,用细胞培养液(无血清)制备细胞悬液,调整浓度为1×105/ml。Transwell 板做好标记,取300 μl 细胞悬液加入Transwell 板的上室,移入37℃培养箱培养24 h。取出Transwell 小室,刮出未浸润细胞,甲醛固定,晾干,吉姆萨液避光染色,PBS 液洗涤3 次。晾干,显微镜下随机观察5 个视野,计数穿越小室膜的细胞数量,评价cofilin 对胶质瘤细胞浸润的影响。
采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据。计量资料用均数±标准差()表示,行t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。
24、48 h 观察组胶质瘤细胞迁移速率显著高于对照组,差异有统计学意义(P< 0.05)。见表1。
表1 两组胶质瘤细胞迁移速率比较(%,±s)
组别n24 h48 ht 值P 值观察组 633.32±5.6168.95±4.3312.3150.000对照组 613.18±2.1625.22±3.477.2150.000 t 值8.20619.304 P 值0.0000.000
观察组观察到的胶质瘤细胞浸润个数[(196.33±38.43)个]显著高于对照组[(83.26±25.52)个],差异有统计学意义(t=5.481,P=0.001)。见图1。
胶质瘤占脑肿瘤的40%~50%,临床常见。胶质瘤很难根治,术后往往容易复发,不同级别的胶质瘤预后各不相同,高级别胶质瘤患者病情进展较快,术后短时间内就可复发,生存时间也往往相对较短。对胶质瘤的治疗主要是早发现、早治疗,以改善预后。微丝与微管、中等纤维共同组成细胞质骨架。细胞质骨架具有弥散性、整体性、变动性,维持细胞形态,在细胞运动、能量转换、物质运输、细胞分裂、信息传递、基因表达、细胞分化等过程中发挥重要的作用。真核细胞中的微丝由肌动蛋白组成,直径7 nm,程度不一,实心细丝状骨架纤维。微丝具有支架功能,肌肉收缩功能,细胞定向运动、保质环流、细胞内吞、外涂,细胞分裂,细胞分化,微绒毛收缩,信息传递等作用[6-8]。cofilin 蛋白通过磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇、pH 改变等进行调节细胞内结合和解聚F 肌动蛋白,介导细胞内信号途径,从而调节肌动蛋白骨架的重组[9-11]。在神经细胞中,细胞骨架中的肌动蛋白在多种重要的生理活动中发挥作用,包括肌肉收缩,胞质,神经纤维再生,神经纤维退行性改变等。在这个过程中还需要一些调节肌动蛋白聚合和解聚的蛋白参与。在一定条件下,cofilin 蛋白可使肌动蛋白微丝解聚,从而影响细胞骨架蛋白动力学。从基因上,cofilin 基因主要有cofilin-1 和cofilin-2,表达相应的蛋白质。cofilin-1 主要表达在非肌肉组织,尤其以脑组织为主。而cofilin-2 主要表达在肌肉组织中,例如骨骼肌、心肌等。cofilin-1 参与神经元的分化。在神经细胞中,微丝的解聚与重塑影响神经元的极化以及树突和轴突的形成,cofilin-1 通过解聚微丝参与神经元的分化过程。cofilin-1 调节细胞骨架的变化,影响神经元的定向运动,进而影响神经系统的正常发育以及损伤后的修复过程。cofilin 蛋白还参与调节神经突触的可塑性[12]。
研究显示,食管癌组织cofilin-1 阳性高表达与临床分期晚、淋巴结转移、预后差有关[13]。王静等[14]的研究结果也显示,cofilin-1 的表达水平与慢性粒细胞白血病患者的不良生存预后有关。cofilin-1 与胃肠道间质瘤浸润的深度、肿瘤的直径、病理性核分裂象正相关[15]。本研究结果与既往研究结果相似,过表达cofilin 的GSC 单核细胞迁移速率要显著高于基因沉默的细胞,发生浸润的细胞个数也显著多于基因沉默的细胞(P< 0.05)。cofilin 通过诱导片状伪足的形成,进而影响细胞运动的方向。cofilin参与信号转导从而参与细胞运动及形态的改变,在肿瘤细胞的转移、浸润过程中发挥重要的作用[16-17]。本研究未对cofilin 影响胶质瘤细胞的迁移和浸润的具体机制进行研究,期待在今后的研究中进一步分析。
综上所述,cofilin 可促进胶质瘤细胞的迁移与浸润,可能与cofilin 参与胶纸瘤细胞运动、信息传递、细胞分裂、基因表达等有关,期待在今后的研究中能够对具体机制进行进一步分析。