RNAm6A去甲基化酶FTO在体外培养肝细胞中的脂肪代谢作用研究

王 倩 折瑞莲 沙文琼 林湖滨

深圳市人民医院产科，广东深圳 518020

代谢性疾病是肥胖人群健康的主要威胁，通过多种方法寻找克服肥胖问题仍然不能有效合理调控肥胖人群肝脏细胞代谢平衡[1-2]。脂肪与肥胖相关基因（fat mass and obesity-associated，FTO）于1999年被发现，2007年经鉴定其编码为去甲基化酶[3-4]。随着研究的深入，发现FTO 与多种疾病有关，如代谢紊乱、肿瘤、肥胖、心脑血管疾病等[5-7]。FTO 编码去甲基化酶，其底物是RNA，催化RNA 上的6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）发生去甲基化，调控基因表达，参与细胞的多种生命活动[8]。FTO 在不同组织中的功能不同，如在黑色素瘤、宫颈癌、乳腺癌、急性髓性白血病中具有癌基因的功能；在肝内胆管癌、卵巢癌、肾癌则发现其具有抑癌基因的作用[9-10]。对于正常肝细胞的代谢调控作用尚不清楚，本研究采用正常肝细胞HL-7702，研究FTO 如何通过m6A 调控肝细胞增殖、脂肪代谢相关基因水平变化，为脂肪肝等肝脏疾病提供治疗与指导。

1 材料与方法

1.1 一般材料

RPMI-1640 培养基（KGM31800）、CCK-8 试剂（KGA317）、TMG、cycloleucine 均购自南京凯基；m6A甲基化检测试剂盒（ab233488）、甘油（ab133130）均购自Abcam；甘油检测试剂盒购自Elabscience（E-BCK261-M）；胎牛血清购自杭州四季青（11011-8611）；FTO-OE 过表达载体购自广州基旦生物；FTO-sh干扰载体购自广州艾基生物；RT-qPCR 反转录试剂盒购自Bio-Rad（1725121）；qPCR 引物购自上海生工。抗体购自CST 公司；人肝正常细胞HL-7702 购自武汉普诺赛公司（CL-0111）；293T 细胞购自中国科学院上海细胞库（GNHuh7）；SDSPAGE 凝胶试剂盒（P0012A）、蛋白裂解液RIPA（P0013C）均购自碧云天；lipofectamine 2000（11668030）、TRIzol（1590618）均购自Invitrogen。

1.2 仪器与设备

qPCR 仪器（Bio-Rad，M400）、酶标仪（博璐腾，型号DC220）、超净台（苏州超净，型号WT-2ND）、二氧化碳培养箱（Thermo，型号BB150）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 使用RPMI-1640 培养基培养人肝正常细胞HL-7702、293T 细胞，并置于37℃、5%CO2培养箱。

1.3.2 FTO-OE 及FTO-sh 载体构建 构建FTO 过表达及干扰载体，使用293T 细胞。DNA（带有绿色荧光蛋白标签）与转染试剂的比例为1∶2～1∶3。250 μl Opti-MEM 稀释2 μg 目的基因载体，室温静置5 min。将脂质体混合液慢慢滴加到质粒混合液管中加入细胞。4～6 h 后，弃掉培养基，补入含10%胎牛血清的正常培养基。

1.3.3 外源性甲基化激活剂三甲基甘氨酸与外源性甲基化抑制剂环亮氨酸分别对细胞增殖的影响 不同浓度的TMG 对肝细胞增殖的影响：HL-7702细胞贴满96 孔板后进行处理，试验分为7 组，三甲基甘氨酸终浓度分别为0、1、2、4、8、16、32 mmol，处理48 min 后CCK-8 法检测细胞增殖情况，并使用Graphpad Prism 6.0 计算IC50。不同浓度的cycloleucine 对肝细胞增殖的影响：HL-7702 细胞贴满96 孔板后进行处理，随机分为4 组，cycloleucine终浓度分别为0、10、20、40 mmol，处理24 min 后采用CCK-8 法检测细胞增殖情况。

1.3.4 qPCR 分析 收集药物作用后48 h 的细胞，加入200 μl Trizol。加入0.2 ml氯仿，轻微振荡15 s，静置2 min。4℃离心，12 000 g，离心15 min，取上清。加入0.5 ml 异丙醇，室温静置10 min。4℃离心，12 000 g，离心10 min，弃上清。加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀。4℃离心，7500 g，离心5 min，弃上清，加入DEPC水溶解。反转录条件：37℃，15 min；85℃，5 s。qPCR 体系：模板，1 μl；F 引物，0.4 μl，R 引物（10 μmol），0.4 μl；2x PerfecStar qPCR SuperMix，10 μl；Nuclease free-Water，8.2 μl。使用两步法分析基因表达，程序如下，95℃ 5 s，60℃ 5 s，然后42 个循环扩增分析基因表达（95℃，15 s；60℃，1 min）。使用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达，以GAPDH 表达为对照。

1.3.5 Western blot 实验 收集药物作用后的细胞，蛋白裂解变性，BCA 法测定蛋白浓度。SDSPAGE 胶电泳分离样品，并通过湿转法将蛋白转移到PVDF 上。5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，TBST 洗膜3 次，将稀释好的一抗浸没PVDF 膜，4℃孵育过夜。第2 天，TBST 洗膜3 次，然后加入相应的二抗，室温孵育1 h，化学发光法进行显影。

1.3.6 m6A 甲基化定量检测 细胞加药处理后48 h收集细胞。RNA 结合：加80 μl 结合液到酶标板。m6A RNA 捕获：加50 μl 稀释的捕获抗体液。50 μl 稀释的抗体检测液，孵育30 min。50 μl 稀释的增强液，孵育30 min。标准曲线制作，使用1x TE 缓冲液稀释阳性对照物，浓度为0.5 ng/μl。洗脱缓冲液以1∶2000 比例稀释抗体检测液。根据使用0.5 ng/μl 阳性对照液和1×TE 缓冲液制备6 种不同浓度，分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2 ng/μl，绘制标准曲线。

1.3.7 甘油水平检测 甘油水平检测按照试剂盒说明书进行。细胞加药处理，48 h 后收集细胞。按比例每（1～2）×106细胞加100 μl 裂解液，混匀裂解。65℃左右加热10 min 灭活脂肪酶，可见絮状沉淀出现。5000 r/min 离心5 min。工作溶液的配制，按R1∶R2=4∶1 比例，即取4 ml 试剂R1 试剂与1 ml 试剂R2 试剂混合。标准品稀释，用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体，绘制标准曲线。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，行t检验，计数资料用[n（%）]表示，行χ2检验，P< 0.05 为差异有统计学意义。使用Graphpad Prism 6.0 软件作图。

2 结果

2.1 Western blot及qPCR分析FTO表达水平

在人正常肝细胞HL-7702 过表达FTO，Western blot 及qPCR 分析其表达，发现FTO 的mRNA 与蛋白表达水平皆有提高（图1A～B）。接下来，使用同样的方法干扰FTO 表达，发现FTO 的mRNA 与蛋白表达水平皆有降低，差异有统计学意义（P< 0.05）（图1C～D）。这些结果表明，构建的FTO 过表达载体（FTO-OE）及干扰载体（FTO-sh）均有效果。

2.2 三甲基甘氨酸与cycloleucine对肝细胞活性影响

参考相关研究报道[11-12]，TMG 具有抑制细胞活性的效果，细胞经过TMG 作用后，经计算其IC50 为8.32 mmol，为了便于药物浓度计算，在后续的实验里TMG 浓度均为8.5 mmol（图2A）。cycloleucine具有促进细胞衰老的效果，在一定的浓度范围内具有促进细胞增殖的效果，结合图2B，本研究选定其浓度为10 mmol 开展后续研究。

2.3 FTO对肝细胞增殖活性效果

与NC-OE 对照组相比，当FTO 过表达后，FTO-OE 组增殖活性变化显著增高（图3A）；细胞增殖活性受到TMG 抑制（图3A）；当细胞过表达FTO 时，其增殖活性受到TMG 抑制（图3A）。与NC-sh 对照组相比，加入cycloleucine 后，其本身增殖活性变化差异不明显（图3B）；与NC-sh 对比，FTO-sh 增殖活性显著降低（图3B）；但加入cycloleucine 后，FTO-sh 增殖活性降低得到缓解（图3B），差异有统计学意义（P< 0.05）。

2.4 FTO对肝细胞产生甘油效果影响

与NC-OE 对照组相比，当FTO 过表达，细胞甘油产生水平显著提高（图4A）；甲基激活剂TMG 药物降低了细胞甘油水平（图4A）；FTO 过表达逆转了TMG 的效果，导致细胞甘油水平提高（图4A），差异有统计学意义（P< 0.05）。与NC-sh 对照组相比，干扰FTO 的表达，细胞甘油产生水平降低（图4B）；抑制剂cycloleucine 药物显著提高细胞甘油水平（图4B），且FTO-sh 逆转了cycloleucine 对甘油水平的提高，导致细胞甘油水平降低（图4B），差异有统计学意义（P< 0.05）。

2.5 FTO对肝细胞代谢基因表达水平分析

FTO 调控脂肪分解相关基因（ATGL）、成脂分化基因（c/EBPβ）、脂肪酸从头合成相关基因（FAS）等脂肪代谢基因水平[13-15]。当FTO 过表达，ATGL 表达水平显著降低，c/EBPβ、FAS 水平显著提高（图5A）；当被TMG 药物作用后，ATGL 表达水平有所提高，仍然低于NC-OE 对照组（图5A）；c/EBPβ 与FAS 表达水平显著提高（图5A），差异有统计学意义（P< 0.05）。FTO-OE 逆转了TMG 药物的效果，导致ATGL 表达水平降低，c/EBPβ 与FAS 水平显著提高（图5A）。

当干扰FTO 表达时，ATGL 水平升高（图5B），c/EBPβ 与FAS 水平降低（图5B）。当细胞被cycloleucine 药物作用后，ATGL 水平进一步升高（图5B），c/EBPβ 与FAS 水平显著性降低，差异有统计学意义（P< 0.05）（图5B）。接下来进一步研究，当干扰FTO 表达，细胞受到cycloleucine 作用后，本应该出现ATGL 水平升高、c/EBPβ 水平降低。但是，ATGL 水平却降低，c/EBPβ 水平差异无统计学意义（P> 0.05）（图5B）。只有FAS 的实验结果符合预期（图5B）。

2.6 甲基化m6A水平变化

FTO 编码去甲基化酶，影响细胞m6A 的甲基化水平。为了进一步研究FTO 如何调控以上实验结果，进一步研究细胞RNA 甲基化水平变化。当细胞FTO 过表达，m6A 甲基化水平降低；当干扰FTO 的表达，m6A 甲基化水平升高，差异有统计学意义（P< 0.05）。见图6。

3 讨论

FTO 是脂肪与肥胖相关基因，编码m6A 去甲基化酶，调控RNA 甲基化水平，参与细胞增殖、存活，与代谢病存在深度关系，如糖尿病、肥胖、肾病等[13]。RNA 的m6A 修饰功能很重要，目前关于m6A 在肿瘤发生、肥胖、脂肪代谢等疾病中愈发明确[14]。FTO 通过多种途径调节脂肪代谢，如通过过氧化物酶体、与脂肪相关的促生成因子等，从而调控肥胖的发生发展。新的研究表明，m6A 与2 型糖尿病关系十分密切，FTO 作为m6A 去甲基化酶广泛参与2 型糖尿病的发生发展。有研究表明，在2 型糖尿病模型研究中，发现高糖高脂饮食促进FTO 表达而导致m6A 甲基化水平显著降低[15]。

另外，还有研究表明，在大鼠高糖高脂饮食实验中发现，FTO 过表达而导致甘油及三酰甘油表达水平提高，进一步研究发现，与代谢紧密相关的基因，如ATGL、c/EBPβ 与FAS 表达水平皆有显著性的变化[16]。本研究利用CCK-8、Western blot、qPCR 等方法，分析FTO 与正常肝细胞HL-7702 增殖、甘油、代谢基因等变化研究，发现FTO 过表达促进肝细胞增殖、甘油水平提高，ATGL 水平降低、c/EBPβ 与FAS 水平升高，m6A 甲基化水平降低。当干扰FTO 表达时，肝细胞增殖水平减慢，甘油水平降低，FAS 水平升高。

FTO 通过多种信号通路调节脂肪代谢，如FTO基因通过改变m6A 水平可调节RUNX1T1 基因的表达，其存在2 种不同的异构体。有研究表明RUNX1T1 基因能够调节c/EBPβ 的活性[17]。有研究发现缺失FTO 基因并不会影响c/EBPβ 的表达水平，推测FTO 基因有可能通过一条独立于c/EBPβ 之外的路径来发挥作用[18]。本研究中，FTO 调控c/EBPβ的表达，FTO 过表达促进c/EBPβ 的表达，提示FTO可能通过调节RUNX1T1 基因的表达调控脂肪代谢。

除此之外，本研究还发现一个异常的现象，当干扰FTO 表达时，细胞受到cycloleucine 作用后，ATGL 水平降低、c/EBPβ 没有显著性差异。值得进一步关注与研究。