我国部分地区Sicinivirus 流行病学调查

王楷宬，姜利建，陈海燕，王素春，庄青叶，5，姜 楠，肖志宇，赵成龙，黄禹丰，李金积，崔成都，孙福亮，徐太辉

（1.中国动物卫生与流行病中心，山东青岛 266032；2.青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266114；3.延边大学，吉林延吉 133003；4.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023；5.山东畜牧兽医职业学院动物医学院，山东潍坊 261061）

Sicinivirus 是一种禽类新发病毒，为单股正向RNA 病毒[1]。在国际病毒学分类委员会第十次病毒分类报告（2017 年）中，Sicinivirus 被分类为微RNA 病毒科的一个新属，目前仅有1 个“种”（species），即Sicinivirus A。根据基因序列将其分为5 个基因型，Sicinivirus A1—A5，缩写为siv-A1—A5。

目前Sicinivirus 的致病性和致病机理尚不清楚。有研究认为其可能是肠道中一种常在病毒，也有研究推测该病毒可能和其他肠道病毒共感染导致并发症，可能与鸡的发育迟缓综合征（RSS）、腹泻和吸收不良综合征（MAS）有关。肉鸡传染性发育迟缓综合征（infectious stunting syndrome，ISS）早在1949 年就有报道，20 世纪70 年代后期呈全球性发生，波及许多国家和地区，临床研究以及人工感染试验均证实该病具有传染性[2]。

2014 年，Sicinivirus 在爱尔兰首次被发现，现世界各地都有检出该病毒的报道，如爱尔兰、中国、英国、匈牙利、巴西都检测到了该病毒。Bullman等[1]对爱尔兰一家商品鸡肉加工场采集的30 份鸡泄殖腔样品进行检测，发现Sicinivirus 阳性率为73%。Zhou 等[3]对江苏省盐城市的商品鸡场进行检测，发现3 个养殖场的17 份鸡粪便样品均为Sicinivirus 阳性，虽然样品量较少，但如此高的阳性率表明该地区商品鸡场中可能存在广泛的感染。此外，利用高通量测序技术，在中国香港、英国、匈牙利和巴西的鸡中也检到了该病毒[4-7]。

目前，Sicinivirus 的研究还处于初级阶段，仅部分国家进行了该病毒检测，研究数据极为有限。该病毒在我国的流行情况尚不明晰。本研究对我国部分地区进行了Sicinivirus 流行病学调查，并分析了其感染率与地域、宿主、场户类型之间的关系。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年下半年，分别在江苏、广西、河北、安徽、广东、上海、湖北和江西等8 个省（自治区、直辖市），随机选择25 个场点，采集240 份家禽咽喉/泄殖腔双拭子样品，将同一只家禽的泄殖腔拭子和咽喉拭子合并作为1 份样品保存。共采集1 920 份样品，其中鸡、鸭、鹅、鸽、鹧鸪的咽喉/泄殖腔双拭子样品分别为1 221、419、40、235 和5 份。采样场点涉及15 个农贸市场、7 个批发市场、1 个屠宰场和2 个养殖场。

咽喉/泄殖腔双拭子样品放置在装有PBS-甘油采样液的离心管中，将存有样品的离心管置于管架并编号，保持直立状态置于放有冰袋的泡沫保温盒中运输，-80 ℃保存。

1.2 主要试剂

QIAxtractor 高通量核酸提取仪（cador Pathogen 96 QIA cube HT kit），购自德国Qiagen公 司；PathAmp FluA Reagent Kit、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Batcode Aaptors、Qubit 核酸浓度测定仪配套试剂，均购自Life technologies 公司。

1.3 引物合成

检测引物参考Zhou 等[3]扩增Sicinivirus 编码3D 蛋白保守区cDNA 所设计的1 对引物S8F 和S8R，用于扩增652 bp 的3D基因片段。上游引物：5′-GCTCTATTTCTCGCGTTGCAAT；下游引物：5'-GCCTCCCTTCATGATGTACCAC。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。

1.4 样品PCR 检测和测序鉴定

取出-80 ℃保存的双拭子，待解冻后，室温下10 000 r/min 离心5 min。每个样品取200 μL 上清液加入96 孔加样槽中，使用 QIAxtractor 高通量核酸提取仪及其配套试剂盒提取病毒RNA，将提取的核酸-80 ℃保存备用。利用HiScript II One Step RT-PCR Kit 试剂盒，对提取的病毒RNA 进行RT-PCR 扩增。扩增程序：50 ℃ 30 min；95 ℃2 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40 个循环；72 ℃ 5 min。

PCR 产物经电泳、纯化回收后，由上海生工生物工程公司测序；利用 DNAstar 软件中的Seqman 程序对所测序列拼接，然后对拼接结果进行BLAST 比对，比对结果为Sicinivirus 的判为阳性样品。

1.5 数据统计

对PCR 检测及测序结果，利用IBM SPSS Statistics 22 软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，以P=0.01 作为检验水准，分析不同地区、不同宿主、不同场点的个体阳性率。

2 结果与分析

2.1 不同地区

PCR 检测结果显示：在25 个场点中13 个为阳性，1 920 份样品中，共检出134 份为Sicinivirus阳性，个体阳性率为6.97%（134/1 920），其中河北、湖北、上海、广东、江苏、江西、广西和安徽的个体阳性率分别为24.16%（58/240）、10.83%（26/240）、5.83%（14/240）、5.41%（13/240）、4.16%（10/240）、2.50%（6/240）、1.66%（4/240）和1.25%（3/240），不同地区个体阳性率差异显著（df=7，χ2=121.800，P＜0.01）。

2.2 不同宿主

在1 920 份样品中，共检出134 份阳性样品，其中132 份的宿主为鸡、1 份为鹅、1 份为鸽，鸭和鹧鸪中未检测到Sicinivirus，鸡、鹅和鸽的个体阳性率分别为10.81%（132/1 221）、2.44%（1/41）和0.42%（1/235），表明鸡为Sicinivirus 的主要易感宿主（P＜0.01）。

2.3 不同养殖类型

不同养殖类型检测结果显示，农贸市场、批发市场和屠宰场的个体阳性率分别为3.00%（18/600）、6.23%（58/930）和24.16%（58/240），在150 份养殖场采集的样品中没有检出Sicinivirus。不同场点类型阳性率之间的差异任意期望频率均大于5，采用Pearson 卡方检验，显示不同类型场点的阳性率差异显著（df=4，χ2=138.169，P＜0.01），屠宰场为最易感场点。

3 讨论

本研究首次在我国开展Sicinivirus 流行病学调查。本研究采取的方法为配额抽样的非随机抽样方法，可能会出现选择性偏倚和一定的局限。从1 920 份样品中检出阳性样品134 份，个体总阳性率为6.97%（134/1 920），场点总阳性率为52.00%（13/25），所有被调查的省（自治区、直辖市）都检测到了Sicinivirus，说明该病毒分布较为广泛。不同地区阳性率差异显著，河北、湖北的阳性率较高，广东、上海、江苏其次，而安徽、广西、江西较低。河北、湖北的所有场点均检测到Sicinivirus，是因为河北均为屠宰场采集的鸡拭子，湖北均为批发市场采集的鸡拭子和鸭拭子，所以这两个地区的阳性率较高可能与宿主、场点类型的不同有一定关系。

从宿主分析结果来看，鸡的阳性样品数占总阳性样品的98.50%（132/134），鸡群的个体阳性率为10.81%（134/1 221）远高于其他宿主，而鹅和鸽的阳性率分别为2.44%（1/41）和0.42%（1/235），不同宿主阳性率差异显著。之前的研究还未发现该病毒可以感染除鸡之外的其他宿主。本研究表明，鸡依然是最主要的易感宿主，而鹅和鸽也是宿主之一。下一步将对能够感染鹅和鸽的病毒株进行基因分析。

从场点类型来看，不同类型场点阳性率差异显著，表明家禽养殖环境与该病毒的感染有较大关系。在采集样品的4 种场点中，屠宰场阳性率最高，其次是批发市场和农贸市场（统称活禽市场），而养殖场未检测到Sicinivirus。活禽市场的禽流动性高，且相对于养殖场，卫生条件较差，表明病毒在禽间的水平传播较为严重，间接接触也可导致病毒传播。本研究采集样品的养殖场均为规模化养殖场，其饲养环境较好，食物、饮水供应以及粪便处理流程规范，活禽一直处于与外界相对隔离的状态；活禽市场的禽在运输过程中往往会产生应激反应，导致免疫力下降，更易感染病毒，活禽市场以及运输工具消毒不及时，也会导致健康禽受到感染，活禽集中生活在狭小笼子中也会导致病毒交叉感染；屠宰场阳性率最高，与屠宰场卫生条件较差、缺乏消毒等防疫管理措施以及环境污染等因素有关。本研究未对散养户进行调查，因而散养户的Sicinivirus感染情况有待进一步研究。

根据此次流行病学调查结果，建议加强屠宰场和活禽市场的卫生管理，对运送活禽的车辆及时消毒，减少禽类的间接性接触，屠宰场在进行集中屠宰的同时也要注意不同来源养殖场禽类的相互隔离。这些措施能在一定程度上阻断病毒的传播。