浓戊二醛防冻消毒剂的防冻及消杀效果

庞学敏，谢书宇，卢 迪，齐六卫，赵宝凯，杨作丰，刘 俊，高志峰，魏园园，董 娜

（1.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110015；2.华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070；3.沈阳伟嘉牧业技术有限公司，辽宁沈阳 110027；4.沈阳市农业综合行政执法队，辽宁沈阳 110000）

2018 年我国首发非洲猪瘟疫情[1]。非洲猪瘟疫情对我国生猪饲养以及屠宰、运输、兽药、饲料等相关产业都造成了极大冲击，造成的损失不可估量。非洲猪瘟是我国的一类动物疫病，发病率、病死率可高达100%[2]。针对非洲猪瘟，目前仍没有有效的疫苗可用[3]，因此隔离传染源、切断传播途径是最有效的防控措施[4]。其中，消毒是最直接、有效、简单的控制手段之一，做好疫点、疫区消毒工作，可以有效抑制疫情扩散[5]。

浓戊二醛是新一代醛类消毒剂[6]。它不仅克服了甲醛消毒剂的诸多缺点，也具有很强的广谱杀菌能力，是当前醛类消毒剂中应用较广的一种消毒剂，在农业农村部公布的《非洲猪瘟疫情应急实施方案》（第五版）中被列为推荐的消毒剂种类，主要应用于车辆等运输工具、畜舍建筑物、围栏、木质结构物、水泥表面、地面等的消毒，是生猪饲养场常用的开放环境消毒药。

东北地区冬季温度常达-20 ℃以下，室外喷洒浓戊二醛消毒剂很快就会结成冰膜，直接限制了消毒液颗粒的运动，既起不到消毒作用，也会对路面行车安全造成隐患，对疫点、疫区的疫病防控以及省界动物卫生监督检查站、饲养场户的冬季日常消毒造成极大困扰。为解决东北地区冬季消毒问题，向浓戊二醛消毒剂中添加不同量的防冻剂，并开展防冻及消杀效果试验，筛选最佳防冻剂添加量。

1 材料与方法

1.1 材料

防冻剂：主要成分为乙二醇[7]，由沈阳伟嘉生物技术有限公司提供；消毒剂：20%的浓戊二醛成品（批号2020120101），由沈阳伟嘉生物技术有限公司提供；非洲猪瘟病毒：以高致病性Pig/HLJ/2018 毒株为骨架，构建携带GFP 标签的感染性克隆毒株，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（国家非洲猪瘟专业实验室）鉴定和保存；标准菌：金黄色葡萄球菌（G+）与大肠杆菌（G-），购自广州市辰飞生物科技有限公司；营养琼脂：沈阳伟嘉生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 防冻性能测试标准 参照国家卫生健康委办公厅印发的《低温消毒剂卫生安全评价技术要求》。

1.2.2 防冻性能测试试验 将防冻剂分别以2、3、4 mL 的添加量加入到100 mL 浓戊二醛成品中（对应体积分数分别为2%、3%、4%），充分溶解，在-10 ℃条件下放置24 h，记录防冻情况；将防冻剂分别以8、10、12、14 mL 的添加量加入到100 mL 浓戊二醛成品中（对应体积分数分别为8%、10%、12%、14%），充分溶解，在-20 ℃条件下放置24 h，记录防冻情况。将不添加防冻剂的浓戊二醛成品作为空白对照组，在-20 ℃条件下放置24 h，记录上冻情况[8]。

1.2.3 抑菌试验 依据《消毒剂实验室杀菌效果检验方法》（GB/T 38502—2020），用斜面培养基分别培养金黄色葡萄球菌与大肠杆菌[9]，培养好后冷藏备用。配制营养琼脂，灭菌备用。在玻璃平皿中加入20 mL 营养琼脂，凝固后用生理盐水冲洗斜面培养基，取3%的菌液加入凉至45 ℃以下的营养琼脂中，摇匀；取5 mL 加入平皿中，凝固后摆放4 个牛津杯，统一加样量为200 μL（孔径6 mm），分别加入生理盐水（孔1）以及不加防冻剂消毒剂（孔2）、10%防冻消毒剂（孔3）和12%防冻消毒剂（孔4）的100 倍稀释液，盖上陶瓷盖37 ℃恒温培养12～16 h 后观察抑菌圈大小。

1.2.4 体外杀灭非洲猪瘟病毒试验 委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（国家非洲猪瘟专业实验室）开展试验。依据《非洲猪瘟诊断技术》（GB/T 18648—2020），将12%的防冻消毒剂与病毒液等体积均匀混合，在-20～20 ℃的不同温度条件下，每10 ℃设为一档，分别作用10、30、60 min，加入中和剂室温作用10 min；分别以5%、10%、20%的体积分数用水稀释防冻消毒剂，然后接种于已长满单层 PAMs 细胞（猪肺泡巨噬细胞）培养板中，每个稀释度重复4 孔，同时分别设置中和剂对照组、阳性对照组和阴性对照组；放置于37 ℃5% CO2温箱中培养，每24 h 观察细胞状态及病毒复制产生荧光情况[10]，96 h 后统计试验结果。3 种稀释度（体积分数5%、10%、20%）的防冻消毒剂灭活病毒结果判定标准：以阳性对照组细胞90%以上出现明显荧光信号，阴性对照组孔内无荧光信号为前提，若试验组无明显荧光信号，证明非洲猪瘟病毒被完全杀灭，若试验组孔内出现明显荧光信号，证明非洲猪瘟病毒未被防冻消毒剂完全灭活。

1.2.5 消毒剂含量检测 依据《中国兽药典》（2020年）质量标准检测。检测样品：添加防冻剂的浓戊二醛消毒液（体积分数12%）和添加水的浓戊二醛消毒液（体积分数12%）。检测时间：配制成品前以及配制成品后24、48 h。检测试剂：三乙醇胺溶液、盐酸羟胺、纯化水、异丙醇、溴酚蓝乙醇、硫酸滴定液。含量检测方法[11]：取本品1 mL（相当于戊二醛约0.20 g），精密称定，加入体积分数6.5%的三乙醇胺溶液20 mL、盐酸羟胺中性溶液（取盐酸羟胺17.50 g，加水75 mL 溶解，用异丙醇稀释至500 mL，摇匀，加体积分数为0.04%的溴酚蓝乙醇溶液15 mL，用体积分数为6.5%的三乙醇胺溶液滴定至溶液显蓝绿色）25 mL，摇匀，放置1 h；用硫酸滴定液（0.25 mol/L）滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定结果用空白试验校正。每1 mL硫酸滴定液（0.25 mol/L）相当于25.03 mg 戊二醛。戊二醛有效含量=（空白滴定体积-样品滴定体积）×滴定液F 值×25.03/（样品称样量× 规格）/1 000×100%；F 值=实际浓度/名义浓度。

2 试验结果

2.1 防冻效果

不同体积分数的防冻消毒剂在-10℃、-20 ℃条件下，24 h 内防冻性均较好，没有出现冻结现象（表1）。

表1 不同体积分数防冻消毒剂在不同温度下的冻结情况

2.2 抑菌效果

各消毒剂100 倍稀释后，大肠杆菌及金黄色葡萄球菌培养基的抑菌圈均可达到标准要求（＞15 mm），对金黄色葡萄球菌较为敏感，其中添加防冻剂的消毒液抑菌圈平均大于不加防冻剂的消毒液1 mm 左右（表2）。

表2 消毒剂抑菌圈试验结果 单位：mm

2.3 杀灭非洲猪瘟病毒效果

5%稀释的防冻消毒剂在20 ℃条件下作用10 min、10 ℃条件下作用30 min、0 ℃条件下作用60 min 均能完全灭活非洲猪瘟病毒，10%稀释的防冻消毒剂在-10 ℃条件下作用30 min 能完全灭活非洲猪瘟病毒，20%稀释的防冻消毒剂在-20 ℃条件下作用30 min 能完全灭活非洲猪瘟病毒（表3）。

表3 不同稀释度防冻消毒剂与非洲猪瘟病毒作用后荧光观察结果

2.4 有效含量

经硫酸滴定，体积分数12%的防冻消毒剂首次检定结果与24、48 h 后的检定结果标准差为±0.04，有效含量（能够抑菌的最低含量）分别为96.7%、96.2%和95.6%（表4），说明戊二醛有效含量比较稳定，在2020 年兽药典规定的标准范围内（95%～100%）。

表4 体积分数12%防冻消毒液的有效含量检测结果

3 讨论

按照国家卫生健康委办公厅印发的《低温消毒剂卫生安全评价技术要求》，在低温消毒剂说明书规定的最低适用温度下，测试该低温消毒剂是否能保持液体状态。取5 mL 低温消毒剂（应用液）放置于相应低温下过夜（＞8 h），观察并记录其性状。该低温消毒剂保持液体状态，无析出、无结晶，则判定为合格。本试验证明，-10 ℃的环境下，在100 mL 浓戊二醛消毒剂中添加2 mL 防冻剂就可以起到很好的防冻效果，-20 ℃的环境下，在100 mL浓戊二醛消毒剂中添加8 mL 防冻剂也可以起到很好的防冻效果，可以有效解决冬季喷洒消毒药瞬间结冰的窘境和难题。有试验证明，乙二醇作为防冻剂在低温情况下的消毒效果最好[12]。本研究参考卫生健康委消毒技术规范进行低温冷冻试验，试验设计更合理、更标准化。

通过抑菌试验发现，加入防冻剂的浓戊二醛消毒液抑菌效果非但没有降低反而略有提升。这是因为防冻剂的加入，增加了消毒液的流动性，降低了分子扩散阻力，加快了消毒液扩散速率，使其有效工作浓度得到保证甚至提升；而高浓度金属离子和阳离子表面活性剂具有高压渗透作用，可非特异性造成病毒、细菌蛋白变性沉淀，增强其通透性，使其破裂死亡，从而使消毒剂分子更易进入，致使消毒效果有效提升。

经过硫酸滴定试验发现，防冻剂溶解后呈现pH 中性，理化性质稳定，无腐蚀性，不会与各类酸性或碱性消毒剂发生化学反应，抗有机物能力强，受有机物以及温度影响小[13]，混合后长时间放置也不会降低消毒液中有效成分含量，可连续使用24 h。

经体外病毒杀灭试验证明，5%、10%、20%稀释的防冻浓戊二醛消毒液，在设定温度下都对非洲猪瘟病毒有很强的杀灭作用。浓戊二醛对非洲猪瘟病毒的杀灭原理为，消毒剂在低温状态下与病原蛋白质结合，使其发生变性，破坏其生物膜结构，从而抑制转运机制，破坏蛋白质-DNA交联等反应。化学消毒剂中戊二醛具有很强的细胞毒性[14]，结合防冻剂中的高浓度金属离子和阳离子表面活性剂的高压渗透作用，可以导致非特异性病毒蛋白变性沉淀，因而提升了戊二醛分子深入病毒、杀灭病毒的能力。因此，在东北地区气温较低或高污染条件下，加入防冻剂的浓戊二醛消毒液依然具有对非洲猪瘟病毒很高的杀灭能力[15]。

冬天东北地区气温比较低，常规消毒剂在低温状态下容易结冰，消毒效果大打折扣，不能够有效杀灭环境中的病原微生物，尤其是在非洲猪瘟病毒长期存在的大背景下，因气温低而导致环境消杀不彻底，感染病毒的概率大幅增加。而以乙二醇为主要成分的防冻剂经过试验研究发现，防冻效果比较好。乙二醇沸点高、冰点低，是国内外较为常用的稳定剂。配合使用浓戊二醛消毒剂能够杀灭细菌和病毒，尤其是能够杀灭非洲猪瘟病毒，从而为养猪业生物安全及环境消毒保驾护航。本研究结果表明，随着浓度的提升，加入防冻剂的浓戊二醛防冻效果也随着提升，且具有很好的贮存稳定性，能够有效满足北方冬季杀灭非洲猪瘟病毒的需求。