某猪场支气管败血波氏杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染的病原分离鉴定及药敏试验

张 慧，高 洁，刘 爽，郑 辉，董雅琴，李晓成，魏 荣

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.西北农林科技大学，陕西杨凌 712100）

支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）可引起猪的萎缩性鼻炎和支气管肺炎，是猪呼吸道综合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要致病因子之一。支气管败血波氏杆菌多呈散发或地方性流行，可通过空气、猪群间的接触或排泄物传播，带菌母猪通过接触可经呼吸道传给仔猪。该菌可感染任何年龄的猪，以仔猪易感性最大[1]。化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes），又称化脓放线杆菌，是一种机会致病菌，常引起猪、牛、羊等动物的肺炎、乳房炎、心内膜炎、关节炎、皮下脓肿等疾病，严重时可引发脓毒败血症而导致家畜死亡[2]。世界范围内，欧洲国家以及日本、巴西、美国均有该菌感染的报道[3]。目前国内外尚未见关于支气管败血波氏杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染猪的报道。本研究通过对2020 年11 月发生在陕西省某猪场的疫情进行病原检测，分离到支气管败血波氏杆菌和化脓隐秘杆菌，随后进行敏感药物筛选，以期为猪支气管败血波氏杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染的诊断与防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料

根据病料送检信息，陕西省某猪场保育仔猪突然发病死亡，死亡前伴有咳嗽、气喘症状。临床诊断疑似为副猪嗜血杆菌或者猪胸膜肺炎放线杆菌感染。采集病死猪肺脏样品，送中国动物卫生与流行病学中心畜病监测室进行细菌分离鉴定。

1.2 试剂

快速磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒，购自济凡生物科技有限公司；5%绵羊血平板，购自青岛海博生物公司；TSA、TSB 培养基，购自美国BD 公司；胎牛血清，购自杭州四季青公司；2×TaqPCR Master Mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、一步法荧光定量RT-PCR 试剂盒，购自TAKARA 公司；药敏试剂（包括克林霉素、环丙沙星、四环素、诺氟沙星、头孢唑啉、卡那霉素、头孢曲松、庆大霉素、氨苄西林、多黏菌素B、头孢哌酮、红霉素）、细菌生化鉴定管，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 病原检测

将送检的病料分为两份，一份经组织研磨后，用快速磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒提取核酸进行病毒及支原体检测；一份用于细菌分离鉴定。

1.3.1 病毒及支原体检测 依据GB/T 35912—2018、GB/T 35911—2018、GB/T 35901—2018、GB/T 27540—2011、GB/T 35909—2018[4-8]中检测规程，分别对猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2 型、猪瘟病毒、猪肺炎支原体进行荧光定量PCR 或常规PCR 检测。

1.3.2 细菌分离纯化及染色镜检 将送检的病料无菌划线接种于5%绵羊血平板，37 ℃培养48 h后，观察细菌菌落形态；挑取单菌落至含5%胎牛血清的TSB 培养基进行增菌培养，同时对分离菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特征。

1.3.3 生化试验鉴定 将新鲜培养的菌液接种至不同细菌微量生化鉴定管中，37 ℃培养48 h，观察记录结果，参照细菌生化鉴定手册进行判定。

1.3.4 16S rDNA PCR 测序 以煮沸法提取细菌DNA 模板。具体步骤：挑取新鲜培养菌落，加入200 μL 无菌双蒸水混匀后，在沸水中煮沸10 min；冰浴后4 ℃ 12 000 r/min 离心，取上清液作为PCR 反应模板。参照文献[9]中的细菌16S rDNA 通用引物序列（F27：5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'；R1492：5'-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3'）进行扩增，扩增片段大小约1 500 bp。引物由深圳华大基因股份有限公司合成。反应体系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1.0 μL，模板1.5 μL，加无菌双蒸水补足至25.0 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃延伸8 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。将单一目的条带PCR 产物送深圳华大基因股份有限公司测序，并将测序结果在GenBank 中开展比对。

1.4 药敏试验

根据美国临床实验室标准化协会（Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的Kirby-Bauer 纸片扩散法（K-B 纸片法）和判定标准，开展对12 种抗菌药物的药敏试验。用灭菌棉拭子蘸取若干单菌落至1 mL 生理盐水中稀释，将菌液浓度调整至0.5 麦氏比浊度；另取灭菌棉拭子浸润菌悬液，在含有5%胎牛血清的TSA 平皿上均匀涂布；待菌液吸收后，贴药敏纸片，37 ℃培养48 h，观察并记录结果。

2 结果

2.1 病毒及支原体检测

经检测，猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2 型、猪瘟病毒及猪肺炎支原体均为阴性。

2.2 细菌分离培养

经过细菌分离纯化，从病死仔猪肺脏中分离到2 株细菌，分别命名为L1、L2。菌株L1 在5%绵羊血平板上溶血不明显，呈现光滑、湿润、边缘整齐、乳白色菌落，菌落直径为0.5～1 mm（图1-A）；菌株L2 在5%绵羊血平板上呈β 溶血，呈现光滑、湿润、边缘整齐的针尖状乳白色菌落（图1-B）。革兰氏染色及镜检结果显示，L1 为阴性短杆菌（图1-C），L2 为阳性短杆菌（图1-D）。

2.3 生化试验鉴定

生化试验结果（表1～2）显示：菌株L1 对葡萄糖、蔗糖、甘露醇等7 种糖醇的分解试验均为阴性，触酶、氧化酶试验均为阳性，能分解尿素，还原硝酸盐，不产生吲哚，不能分解七叶苷；菌株L2 可以发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖，不能发酵棉籽糖、甘露醇，可发酵山梨醇，触酶试验为阴性，不能分解尿素和七叶苷，不产生吲哚，不还原硝酸盐。经比对，上述两种菌株生化试验特性分别与支气管败血波氏杆菌（L1）和化脓隐秘杆菌（L2）相符合。

表1 分离菌L1 的生化反应特性

表2 分离菌L2 的生化反应特性

2.4 16S rDNA PCR 检测及测序

对两株分离菌分别进行细菌16S rDNA PCR扩增，结果发现，扩增产物均在1 500 bp 处出现明显的目的条带（图2）。将PCR 产物测序后并经Blast 比对，发现菌株L1、L2 的16S rDNA 序列与支气管败血波氏杆菌、化脓隐秘杆菌同源性均达100%。

2.5 药敏试验

K-B 纸片法药敏试验结果（表3）显示，支气管败血波氏杆菌对氨苄西林和克林霉素有较强的耐药性，对头孢唑啉和头孢曲松中度敏感，对其余药物均为高度敏感；化脓隐秘杆菌对12 种抗菌药中的4 种（四环素、多黏菌素B、红霉素和克林霉素）有较强的耐药性，对环丙沙星和诺氟沙星中度敏感，对其余药物均为高度敏感。

表3 两株分离菌药敏试验结果

3 讨论

本试验首先对送检的病死猪肺脏组织样本进行猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2 型、猪瘟病毒、猪肺炎支原体检测，发现均为阴性。然后经细菌分离纯化，从送检样品中分离到2 株细菌，根据培养特性、生化试验和16S rDNA 基因测序结果，鉴定为支气管败血波氏杆菌和化脓隐秘杆菌，从而确诊此猪场发生了支气管败血波氏杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染。

支气管败血波氏杆菌感染可由多因素导致，包括由其他细菌或病毒导致的继发感染或混合感染，或由外界应激因素导致，例如畜禽长途运输、饲养密度过高等[10]。支气管败血波氏杆菌的先期感染也易导致其他多种病原的继发感染，从而增加猪群呼吸道疾病的严重程度。化脓隐秘杆菌是一种共生菌，是动物上呼吸道、泌尿生殖道及皮肤黏膜微生物群的一部分，也可在健康牛瘤胃、猪胃及健康奶牛乳房中分离得到[11-12]，作为一种机会致病菌，常与其他病原体共同感染导致宿主发病[13]。近年来，国内不断有从猪呼吸道疾病中分离出化脓隐秘杆菌的报道[14-18]。但是，在猪呼吸道疾病中却没有支气管败血波氏杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染报道。本研究在国内首次报道这两种细菌在猪体内的混合感染，对今后猪场疫病的诊断和防治具有较好的参考价值。

本研究通过药敏试验，发现筛选出的两株菌对卡那霉素、庆大霉素和头孢哌酮高度敏感。支气管败血波氏杆菌对氨苄西林和克林霉素产生了较强的耐药性，化脓隐秘杆菌对四环素、多黏菌素B、红霉素和克林霉素产生了较强的耐药性，表明临床中可能存在抗生素使用不当情况，需要加以控制。本试验提示，猪场在临床用药时，应尽可能轮换用药，联合用药，按剂量用药，以避免产生耐药菌株。同时，应依据《中华人民共和国农业农村部第250号公告》附件“食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单”，进一步规范养殖用药行为，保障动物源性食品安全。