PITX1、miR-556-3p在乳腺癌肝转移中的表达研究

杨 硕 郭 满 张 浩

据2020年癌症统计数据显示，乳腺癌转移是肿瘤患者死亡的主要原因，其转移部位多为骨、肝脏、脑、肺脏等[1]。对于发生肝转移的患者，若未得到及时治疗其生存期仅为4～8个月，得到治疗的乳腺癌肝转移患者生存期也仅为18～24月[2]。随着生物技术的不断进步，靶向治疗成为近年来乳腺癌肝转移诊治的热点，本研究旨在为乳腺癌肝转移的早期诊治提供可靠的理论依据。

垂体同源框配对同源域转录因子1(pituitary homeobox paired homeodomain transcription 1, PITX1)在成年垂体细胞分化以及肢体发育中发挥重要作用[3]。此外，在肿瘤的发生、发展中作为抑癌基因，与胃癌、乳腺癌等多种肿瘤有关[4,5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由21～25nt组成的非编码小RNA，可参与细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程，miRNA在多种人类肿瘤中上调，作为肿瘤生物学标志物发挥作用[6]。miR-556-3p是miRNA新的一员，有研究表明，乳腺癌细胞中miR-556-5p水平较正常乳腺上皮细胞显著上调，其机制可能为miRNA-556调控SLC43A3表达，从而促使乳腺癌发生侵袭迁徙[7]。目前关于PITX1、miR-556-3p在乳腺癌肝转移中共同作用的研究甚少。因此，本研究通过探究PITX1、miR-556-3p在乳腺癌肝转移中的表达，旨在为乳腺癌肝转移的早期诊断提供参考依据。

资料与方法

1.一般资料：以2019年6月～2021年6月在笔者医院诊治的142例乳腺癌患者为研究对象，≤35岁59例，>35岁83例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期79例，Ⅲ～Ⅳ期63例；原发侧：左侧75例，右侧67例；发生淋巴结转移81例，未发生淋巴结转移61例；组织学分级：1级37例，2级49例，3、4级56例；肿瘤直径：<2cm 39例，2～5cm 61例，>5cm 42例。孕激素受体(progesterone receptor，PR)阳性86例，阴性56例；雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性91例，阴性51例；人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2，Her-2)阳性53例，阴性89例；浸润性导管癌87例，非浸润性导管癌55例。其中，64例乳腺癌肝转移患者为转移组，78例乳腺癌未发生肝转移患者为未转移组。纳入标准：①经影像学检查显示为乳腺癌肝转移；②近3个月未接受过放、化疗及内分泌治疗；③预计生存期>3个月；④病历资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②发生其他器官转移；③患有传染性疾病；④不积极配合治疗者。本研究经患者及家属签署知情同意书，且经笔者医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号：SOP-IRB-KYLW-007)。

2.主要试剂与仪器：兔抗人PITX1抗体购自上海群己生物科技有限公司；山羊抗兔lgG H&L(HRP)购自美国SanatCurz公司；二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购自艾美捷科技有限公司；Trizol试剂购自爱必信(上海)生物科技有限公司；RNA逆转录试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；miScript SYBR®Green qPCR kit试剂盒购自上海恒斐生物科技有限公司；引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；PCR仪购自上海净信实业发展有限公司。

3.样品采集：在手术过程中采集各患者癌组织并浸泡于无液氮RNA样品组织保存液中，-80℃条件下保存备用。

4.免疫组化法检测各组织PITX1蛋白水平：首先组织固定利用10%的甲醛进行，石蜡常规包埋、切片(4μm)。对切片脱蜡、水化、封存。一抗兔抗人PITX1抗体在4℃条件下过夜孵育，二抗采用山羊抗兔lgG在37℃条件下孵育30min。DAB显色、苏木精复染，进一步脱水、封片、镜检。

5.结果评定：PITX1蛋白表达采用半定量评定方法，染色指数(staining index, SI)为染色强度与阳性细胞比例的乘积，SI评分为0～9分，染色强度：无染色记0分，浅黄色即弱染色记1分，黄褐色即中染色记2分，棕褐色即强染色记3分；阳性细胞比例：<25%记0分，25%～50%记1分，51%～75%记2分，>75%记3分。由3名专业人员评分后取其平均值，其中SI≤4分为阴性，SI>4分为阳性。

6.两组患者PITX1mRNA、miR-556-3p水平检测：在各样本中加入Trizol试剂提取总RNA，并检验RNA纯度是否符合试验标准。将RNA反转录为cDNA，按照miScript SYBR®Green qPCR kit试剂盒说明书行qRT-PCR反应，qRT-PCR反应：95℃ 1min，55℃ 30s和72℃ 45s，30个循环，PITX1mRNA、miR-556-3p分别以GAPDH、U6为内参，相对表达量采用2-ΔΔct计算，详见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

结 果

1.两组患者一般临床资料比较：乳腺癌肝转移组和未转移组患者之间年龄、原发侧、肿瘤直径、PR、ER、Her-2比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TNM分期、淋巴结转移、组织学分级、病理类型比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 两组患者一般临床资料比较

2.PITX1在两组中的表达情况：转移组患者PITX1阳性表达率32.81%显著低于未转移组65.38%(χ2=14.922,P<0.05)，详见表3、图1。

图1 PITX1表达情况(×400)

表3 PITX1在两组中的表达情况[n(%)]

3.PITX1mRNA、miR-556-3p在两组中的表达水平：与未转移组比较，转移组患者组织PITX1mRNA水平显著降低(P<0.05)，miR-556-3p水平显著升高(P<0.05)，详见表4。

表4 PITX1mRNA、miR-556-3p在两组中的表达水平

4.PITX1与miR-556-3p的关系：生物信息网站starbase(ENCORI)显示，PITX1与miR-556-3p存在结合位点，详见图2。Pearson相关性分析结果显示，PITX1与miR-556-3p呈显著负相关(r=-0.436，P<0.001)，详见图3。

图2 PITX1与miR-556-3p存在结合位点

图3 PITX1与miR-556-3p的关系

5.多因素Logistic回归分析乳腺癌患者发生肝转移的危险因素：以TNM分期、淋巴结转移、组织学分级、病理类型、PITX1、miR-556-3p水平为自变量，以乳腺癌患者是否发生肝转移为因变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，组织学分级3～4级、PITX1阴性是乳腺癌患者发生肝转移的危险因素(P<0.05)，详见表5。

表5 多因素Logistic回归分析乳腺癌患者发生肝转移的危险因素

6.ROC曲线分析PITX1、miR-556-3p对乳腺癌患者发生肝转移的预测价值：ROC曲线结果显示，PITX1、miR-556-3p、二者联合对乳腺癌患者发生肝转移预测价值的曲线下面积(AUC)分别为0.849(敏感度为81.3%，特异性为92.3%)、0.824(敏感度为85.9%，特异性为83.3%)、0.926(敏感度为90.6%，特异性为82.1%)，详见表6、图4。

图4 ROC曲线分析PITX1、miR-556-3p对乳腺癌患者发生肝转移的预测价值

表6 PITX1、miR-556-3p对乳腺癌患者发生肝转移的预测价值

讨 论

乳腺癌作为全球女性最常见的恶性肿瘤，对女性的生命健康造成了严重的威胁。近年来，乳腺癌的发生率呈不断上升的趋势，其中，肝转移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因之一，且肝转移患者的预后效果仍不容乐观，早期诊断并制定精确的治疗方案对延长乳腺癌肝转移患者的生存期有重要意义[8]。

PITX1是bicoid类的同源域转录因子，位于染色体5q31，参与胚胎发育、后肢形成及垂体细胞分化等生理过程，另外PITX1失调与肿瘤的发生密切相关[9]。刘向华等[10]研究发现，PITX1在三阴性乳腺癌中呈低表达，其水平与患者临床病理特征密切相关，且表明PITX1高表达患者的累计生存率显著高于低表达者。Ohira等[11]研究表明，PITX1通过诱导SOX9表达而下调SOX10和SAMMSON水平，从而抑制黑色素瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。Liu等[12]研究发现，miR-675在胃癌组织中上调，并通过靶向下调其靶标PITX1促进癌细胞增殖、迁移和侵袭，二者的异常表达预测了胃癌患者较差的预后。Jiang等[13]研究报道，非小细胞肺癌细胞系中上调的miR-1204与肿瘤的进展有关，并通过下调PITX1促进癌细胞增殖。上述研究表明，PITX1在多种肿瘤中发挥抑癌作用，但其在乳腺癌及乳腺癌肝转移中的表达尚未明晰。本研究中乳腺癌肝转移组和未转移组患者TNM分期、淋巴结转移、组织学分级、病理类型比较，差异有统计学意义。转移组患者PITX1阳性表达率显著低于未转移组，且转移组PITX1mRNA水平显著下调，提示PITX1参与乳腺癌肝转移过程。多因素Logistic回归分析显示，组织学分级3～4级、PITX1阴性是乳腺癌患者发生肝转移的危险因素，提示临床中应重点检测上述危险因素，合理制定治疗方案，减少肝转移概率。进一步ROC曲线结果显示，PITX1预测乳腺癌患者发生肝转移的AUC为0.849(敏感度为81.3%，特异性为92.3%)，提示PITX1对乳腺癌患者是否发生肝转移有一定的评估价值。

miRNA是一类高度保守的非编码RNA，通过与其靶基因特异性相结合而参与多种细胞生物学功能，miRNA可调控人类约30%的基因表达，在肿瘤生物学发展中发挥关键作用[14]。miR-556-3p是miRNA家族中重要的一员，梁磊等[15]研究发现，miR-556-3p在子宫内膜癌组织中的表达较癌旁组显著上调，其机制可能为miR-556-3p通过靶向抑制SASH1从而促进癌细胞的活力和生长。Lu等[16]研究报道，过表达的miR-556-3p通过靶向DAB2IP而促进食管癌细胞的侵袭和活力。白文辉等[17]研究表明，miR-556-3p在乳腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，过表达的circPTPRA通过靶向下调miR-556-3p，可抑制癌细胞MDA-MB-231的生长和迁移。上述研究表明，miR-556-3p为致癌基因，其通过与靶基因相结合调控细胞的增殖和生长。

本研究中，与未转移组比较，转移组miR-556-3p水平显著升高。Pearson相关性分析结果显示，PITX1与miR-556-3p呈显著负相关，提示二者可能存在某种关系共同参与乳腺癌肝转移的发生。ROC曲线结果显示，PITX1、miR-556-3p联合预测乳腺癌患者发生肝转移的AUC为0.926(敏感度为90.6%，特异性为82.1%)，并显著高于各单一指标，提示二者联合对乳腺癌患者是否发生肝转移具有较优的预测价值，对二者水平异常的乳腺癌患者应加强病情监测，预防肝转移的发生。

综上所述，PITX1、miR-556-3p在乳腺癌肝转移患者中表达异常，二者与肝转移的发生密切相关，且对乳腺癌患者发生肝转移具有一定的预测价值。今后将扩大样本量，开展深入研究，从而为乳腺癌肝转移的诊治提供理论基础。