基于HPLC-Q-TOF MS的网络化技术对宁夏枸杞根皮的化学成分研究

何春娴，陈靖枝，杨静玲，李舂龙,3，马晓莉,3，南泽东,3，江志波,3

(1.福州大学化学学院，福建 福州 350108；2.北方民族大学化学与化学工程学院，化工技术基础国家民委重点实验室，宁夏 银川 750021；3.宁夏低品质资源高值化利用技术研发人才小高地，宁夏 银川 750021)

宁夏枸杞LyciumbarbarumL.与枸杞L.chinenseMill.的干燥根皮均作为中药地骨皮在临床上使用[1]。地骨皮无毒、味甘、性寒，归肺、肝、肾经，具有凉血除蒸、清肺降火之功效，临床上常用于治疗阴虚潮热、骨蒸盗汗、内热消渴等病症[2]。目前，对地骨皮的化学成分和药理活性的研究主要集中于枸杞的干燥根皮，而对宁夏枸杞根皮的研究则鲜有报道。研究表明[2-8]，以枸杞干燥根皮为来源的地骨皮粗提物包含萜类、甾醇类、有机酸、生物碱、环肽类等化学成分，具有降血糖、降血压、降血脂、抗菌、抗病毒等多种药理活性。

液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术因具有高灵敏度、低检出限等优点，在复杂样品分析检测中发挥了重要作用，已成为中草药研究的重要工具[9]。随着人们对中药化学成分研究的不断深入，发现的化合物数量已超过百万种，发现新结构、新活性化合物的难度不断增加[10]。对复杂的海量HPLC-MS/MS数据的高通量分析和处理制约了串联质谱在中草药分析中的应用，如果不能将全部数据进行解读，必将造成数据浪费[11]。因此，需要开发新方法分析中草药中的微量化学成分。

近年来，分子网络化(MN)作为化合物分析的重要辅助手段，在复杂样品的化学成分识别、检测和分离技术等方面得到了广泛应用[12-13]。它基于不同串联质谱数据中相似或相同的碎片离子和中性丢失可能代表结构(片段)的相似或相同，从而将结构相关的化合物按照相似程度进行可视化聚类。目前，分子网络化分析是在GNPS(global natural products social molecular networking, https:∥gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp)网站实现的。GNPS是由全世界质谱学家联合组织的基于网络的质谱系统，迄今为止已形成包含近70万种化合物的MS/MS免费数据库，可对样品的串联质谱数据进行分析比较，将具有相似结构的化合物网络化聚类[14]，以成簇发现天然产物，为全面研究复杂的HPLC-MS/MS数据提供帮助。因此，分子网络化可实现对中草药的常量化合物的结构排重、微量化合物的结构分析和结构类似物的聚类分析。Liang等[12,15-16]将分子网络化技术应用于微生物化学、天然产物化学和天然药物化学，分析了不同物种中的微量化学成分，发现了尿苷肽类、黄酮类、皂苷类和二萜生物碱类等多种化学成分。

本研究拟基于高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF MS)和分子网络化技术分析宁夏枸杞根皮水提物的化学成分，旨为宁夏枸杞根皮来源地骨皮的质量控制提供方法参考。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Agilent 6530 Q-TOF系统(包含电喷雾离子源、自动进样器、柱温箱)、ZORBAX Extend C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美国Agilent公司产品；FA1004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司产品。

1.2 样品与试剂

宁夏枸杞根皮：2021年采自宁夏回族自治区中卫市中宁县，由北方民族大学生物科学与工程学院任玉峰教授鉴定为宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的根皮，现保存于北方民族大学植物标本室(标本号为NMUDGP-20190718-1)。

乙腈：色谱纯，上海泰坦公司产品；屈臣氏蒸馏水：深圳屈臣氏蒸馏水有限公司产品；甲醇、乙醇：分析纯，北京化工厂产品；Sep-Pack C18固相萃取柱：美国Waters公司产品。

1.3 供试品溶液的制备

称取20.0 g干燥宁夏枸杞根皮，浸泡于100 mL纯水中，油浴加热至微沸(油温控制在100 ℃)，提取2 h后，用纱布过滤，收集滤液。重复提取滤渣3次，合并所有滤液，减压蒸馏(< 40 ℃)至残留液体积约为100 mL。取10.0 mL残留液于15.0 mL离心管，以3 000 r/min离心10 min，上清液转移至10.0 mL注射器中，连接Sep-Pak C18固相萃取柱，依次使用2 mL纯水、50%甲醇水溶液和纯甲醇进行洗脱，其中50%甲醇水洗脱液用于HPLC-Q-TOF MS分析。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 Agilent ZORBAX Extend C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：A为水，B为乙腈；等度洗脱条件：0～40 min (5%～95%B)；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

1.4.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正、负离子检测模式；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化气压力310 kPa；毛细管电压4.5 kV；质量扫描范围m/z100～300、300～2 000。

1.5 分子网络化分析条件

采用ProteoWizard软件将HPLC-MS/MS采集得到的原始二级质谱数据文件转化为mzXML格式，在GNPS上建立分子网络；运用Cytoscape软件使其可视化，然后借助GNPS平台分析分子网络化，得出已知化合物；再根据分子网络中节点与节点之间的相关性，比较相关节点间质谱数据的异同，得出已知化合物的类似物或其他未知物。

计算参数设置：MS/MS碎片离子容差为0.5 u；母离子的m/z公差为1.0；最小余弦分数为0.6；最小匹配碎片离子为4个；网络TOPK为10。使用Cytoscape 3.4.0软件绘制网络图。

2 结果与讨论

2.1 总离子流图分析

宁夏枸杞根皮在正、负离子模式下的总离子流图示于图1。可以看出，低质量数(m/z100～300，图1a,1b)的离子峰数量比高质量数(m/z300～2 000，图1c,1d)的少，且正离子模式下最高峰丰度大于负离子模式下最高峰丰度。保留时间主要位于10～30 min，结合固相萃取处理时50%甲醇水溶液洗脱，推测样品中的化合物以中等极性为主。通过分析二级质谱碎片离子和特征丢失数据，并借助文献[15]，鉴定了21个化合物，包括4个有机酸或酯类(1～4)、12个有机含氮化合物(5～16)和5个其他类型结构(17～21)，列于表1。

注：a,b.m/z 100～300；c,d.m/z 300～2 000图1 宁夏枸杞根皮在正(a,c)、负(b,d)离子模式的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms (TIC) of the root bark of Lycium barbarum L. in positive (a,c) and negative (b,d) modes

表1 HPLC-Q-TOF MS鉴定宁夏枸杞根皮化合物Table 1 Chemical compounds of the root bark of Lycium barbarum L. by HPLC-Q-TOF MS

续表1

续表1

2.1.1有机酸类化合物 有文献[17]报道，利用系统化学分离的方法从枸杞干燥根皮来源的地骨皮提取物中分离得到31个有机酸及其酯类化合物。本研究在宁夏枸杞干燥根皮水提物的50%甲醇洗脱液中提取潜在有机酸化合物离子，根据二级质谱图的特征碎片离子，确定了4个已知的有机酸，示于图2。化合物1、3、4为长链不饱和脂肪酸，通过中性丢失和特征裂解，发现负离子模式下m/z59离子可作为脂肪酸存在的证据之一。在化合物2、3、4中均发生CO2(44 u)的丢失，表明其结构中存在酰氧基或羧基。

2.1.2有机含氮类化合物 早期人们对枸杞L.chinenseMill.的干燥根皮来源地骨皮的研究表明[17]，其含有丰富的有机含氮活性成分，包括莨菪烷型、吡啶型、精胺型、酰胺型等结构，其中地骨皮甲素、地骨皮乙素、二氢咖啡酰酪胺、咖啡酰酪胺等酰胺类化合物备受关注。但对宁夏枸杞根皮来源地骨皮的有机含氮化合物的报道较少。本研究对宁夏枸杞根皮的地骨皮样品进行测定并提取数据，通过与枸杞干燥根皮含氮化合物的结构对比，发现了12个化合物的准分子离子峰，以准分子离子为母离子进行二级质谱分析，推测它们的裂解途径，结果示于图3。在负离子模式下，所有化合物均在酰胺基团附近发生裂解。化合物5和6分别为线性和支链结构，且在化合物6的裂解过程中，支链末端依次丢失氨基(m/z514)、甲氨基(m/z499)和乙氨基(m/z485)，可作为区分二者的差异离子。化合物14、15、16均为环八肽类结构，中心环肽结构通过色氨酸吲哚氮原子与甘氨酸的α碳原子以σ键关环形成，三肽支链通过甘氨酸氨基与中心环肽连接。通过分析质谱碎裂途径，发现支链与中心环连接的部位最容易断裂，如化合物14和15的m/z501离子，以及化合物16的m/z527离子，均为中心五肽环的碎片离子。

图2 宁夏枸杞根皮中有机酸及酯类化合物Fig.2 Organic acids and esters in the root bark of Lycium barbarum L.

2.1.3其他类型化学成分 参考文献[17]报道的枸杞干燥根皮来源的地骨皮成分，发现宁夏枸杞根皮存在一些其他结构类型的物质，如香豆素苷(17)、蒽醌苷(18)、木脂素苷(19)、绿原酸(20)和简单香豆素(21)，示于图4。在二级质谱图中，都具有糖基特征离子(m/z161或163)或糖基的中性丢失(-162 u)，可据此确定结构中存在六碳糖基。如化合物19的母离子失去162 u得到苷元离子m/z359，为失去葡萄糖基的特征裂解。对化合物21进行MS2分析，得到二级碎片离子m/z133、105和77，可能是其准分子离子依次失去1个CO分子形成的。

2.2 分子网络化分析

利用分子网络化技术对宁夏枸杞根皮50%甲醇水洗脱液在负离子模式下m/z100～300和300～2 000范围的数据进行聚类分析，结果示于图5。由化合物2、22、23组成的子集表明，化合物22、23为化合物2的结构类似物，根据二者的二级质谱图推测其结构示于图6。化合物14和15为早期从地骨皮中发现的环八肽类化合物，其准分子离子分别为m/z872.3和895.3。化合物24的准分子离子为m/z1 035.4，与化合物14具有多个相同的碎片离子，在网络中具有相关性，提示二者可能具有相似的化学结构。与化合物14中心环的特征碎片离子m/z501、471、454相比，化合物24的特征碎片离子为m/z664、634、617，分别增加了163 u。而且化合物24的准分子离子(m/z1 035.4[M + H]+)与其碎片离子m/z664之间的差值(Δ371 u)等于化合物14的支链质量，表明化合物24与14具有相同的支链。因此，化合物24比14多的163 u只可能发生在中心环上，且为化合物14中心环插入1个酪氨酸。结合环肽类化合物16的裂解过程(图3)，推测化合物24的断裂位点也是以酰胺键裂解为主，通过分析碎片离子特征，确定酪氨酸残基位于色氨酸与苏氨酸之间。与化合物14相比，化合物24在氨基酸环上增加了1个酪氨酸，由环八肽变为环九肽。同样，化合物25(分子离子峰为m/z1 058.4)与化合物15具有相关性，表明二者可能为结构类似物，进而可以确定化合物25的化学结构。化合物26～30与GNPS数据库收录的化合物一致。

在由99个离子组成的子集中，化合物5或(和)6的准分子离子为m/z529.1，由于缺乏已知化合物对比，目前无法解析；化合物19(m/z521.3)、31(m/z581.2)、32(m/z683.2)具有直接相关性，表明三者具有相似结构，化合物31的准分子离子比化合物19的大60 u，推测化合物31可能比化合物19多2个甲氧基。化合物32的准分子离子比化合物19的大162 u，可能为六碳糖基，推测化合物31和32的结构分别为Lyciumboside A和Lyciumboside B。化合物24、25、31和32均为首次从地骨皮中发现的新结构，且24和25可能为宁夏枸杞根皮中特有的环九肽类成分。

图3 宁夏枸杞根皮中含氮化合物Fig.3 Known nitrogenous compounds in the root bark of Lycium barbarum L.

图4 宁夏枸杞根皮中其他类型化合物Fig.4 Other compounds in the root bark of Lycium barbarum L.

图6 通过网络化聚类分析发现的化合物结构Fig.6 Identified chemical structures by molecular networking analysis

3 结论

本研究利用HPLC-Q-TOF MS技术分析宁夏枸杞根皮水提物，发现了21个已知化合物，与枸杞根皮具有相似的化学组成。借助分子网络化技术在负离子模式下发现并解析了11个化合物，均为首次在地骨皮中报道，其中化合物24和25为首次在地骨皮中检测到的环九肽类成分，为进一步研究地骨皮中环肽类化学成分生物合成机制奠定了基础。该方法快速、简便、准确、消耗样品少，为解析中草药微量成分的化学结构提供了思路。

致谢：感谢中国科学院西北生态环境资源研究院、甘肃省油气资源研究重点实验室的房嬛研究员和陈永欣副研究员提供的质谱测试工作；感谢北方民族大学生物科学与工程学院任玉峰教授提供的物种鉴定工作。