应用基于非变性质谱及串联质谱的碎片互补法分析完整IgA2抗体及其尺寸变异体

陈清蓉，柴胡玲潇，陈 韬，王冠博

(1. 深圳湾实验室细胞分析研究所，广东 深圳 518132；2.昌平实验室，北京 102206；3. 苏州有诺真生物科技有限公司，江苏 苏州 215124；4. 北京大学生物医学前沿创新中心，北京 100871)

蛋白质常因存在多种修饰而呈现异质性。蛋白的糖基化是最常见和多样化的翻译后修饰，影响着蛋白质的构象、稳定性和溶解度，同时在分子识别、信号传导和免疫防御等方面具有关键作用[1-2]。糖基化蛋白分子中含有分子质量及个数各不相同的单糖残基，形成宏观异质性(糖基化位点的占据程度差异)和微观异质性(各糖基化位点的糖链结构差异)，造成较宽的分子质量范围[3]。异质性糖蛋白分子质量的准确测定对于分析蛋白结合关系、生物技术产品的批次差异、质量浓度和比热等多种指标[4]，以及翻译后修饰等有着重要意义。凝胶电泳[4]、体积排阻色谱[5]等基于尺寸测定的传统技术对于异质性蛋白的分子质量测定无法提供足够的准确度。质谱技术可通过测定离子化糖蛋白的质荷比，在已知所测信号价态的前提下，实现高准确度的分子质量测定。

基质辅助激光解吸(MALDI)和电喷雾(ESI)是用于完整蛋白质谱分析的2种常用离子化技术。MALDI离子源主要产生1价蛋白离子，能够较直接地将所测到的质荷比信号转化成蛋白分子质量，但其对糖基化蛋白的离子化效率有限，相应商品仪器提供的质量检测范围受限，且酸性干燥基质的使用不适于检测蛋白间非共价相互作用[6]，因此，MALDI并非糖蛋白体系的最佳离子化方法。虽然ESI已成为分析完整蛋白及其复合物的有力工具[7-9]，其使蛋白携带多重电荷、所得蛋白离子价态未知且呈现多价态分布的特点增大了分子质量测定的复杂程度。针对均质化蛋白(分子质量明确、分布均一)已有较成熟的算法用于价态测定[10-21]，异质性蛋白因其分子质量分布较宽而导致信号峰严重展宽，因不同价态信号间发生重叠而导致谱图高度卷积，严重降低了不同价态离子信号的分辨率(以下简称“价态分辨率”)。此外，由于糖蛋白不同糖型的质子亲和势存在差异，各糖型的价态分布存在差异，因而各价态糖蛋白离子信号的m/z轮廓并不相同。这一现象使得传统价态测定算法的基本假设(即不同价态信号的m/z轮廓一致)不再成立。由于糖蛋白离子信号的分辨率通常不足以达到同位素级别的分辨，即使使用超高分辨的质量分析器(如轨道阱(Orbitrap)、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR))也难以利用针对同位素分辨水平信号开发的算法进行价态测定[22-26]。因此，提高价态分辨率和准确测定价态是测定完整异质性蛋白分子质量的2个先决条件。

对全部蛋白离子进行价态系综还原可以显著提升价态分辨率，并通过提升m/z读数允差提升价态测定的准确性[27]。然而，系综还原无法解决不同价态离子m/z轮廓不一致的问题。与之相对应的“有限价态还原”[28](本文称为“亚群还原”，便于与系综还原区分)方法，首先利用四极杆或离子阱筛选出单一价态离子中质量分布较窄的亚群，然后利用电子转移[28-30]、电子捕获[31]或质子转移还原(PTCR)反应[27]实现这一亚群离子的价态还原。由于还原产物离子各价态的质量分布(mass profile)与前体离子(precursor ion)相仿，且质量分布范围较窄并可人为控制前体离子筛选阶段，这一方法可显著提升电荷测定的准确性，获取价态信号难以分辨的高度异质性蛋白的分子质量。但这些方法需依赖基于电子或质子转移的反应模块，可利用的商品化仪器有限，限制了应用。本课题组利用众多型号仪器所具备的碰撞诱导解离(CID)或高能碰撞解离(HCD)功能开发了碎片互补原理的分析策略[4]，可将目标蛋白上具有特定质量分布的部分解离下来，利用碎裂反应的质量守恒关系(即前体离子分子质量=碎片分子质量+残骸分子质量)为前体离子的价态测定增加额外的约束条件，从而大幅提升价态测定以及分子质量测定的准确度。但相应算法仅在抗体分子共价解离体系中得以证明，尚未在非共价复合物体系中应用。

抗体蛋白在免疫系统中发挥关键作用，且自身或偶联产物可作为靶向生物药物的实体形式，对其结构和相互作用表征具有重要意义。质谱技术广泛应用于抗体分析[32-33]，其中非变性质谱因胜任完整蛋白及其复合物分析、可维系关键非共价作用的特点，可为抗体分析提供修饰程度、高级结构及相互作用等方面独特的结构信息[34-36]。因既往工作多侧重于IgG类抗体，其他类型抗体因修饰、结构的复杂性为质谱分析带来了更多挑战。IgA是血清中高丰度抗体，起中和抗体的作用，并可介导补体系统的替代激活途径。分泌型IgA为外分泌液中最主要的抗体，可在黏膜上抵御微生物感染，在免疫系统中发挥不可或缺的作用[37]。此外，IgA还可以母乳作为媒介，实现免疫功能的母婴传递。新冠病毒感染产妇初乳中病毒特异性IgA的含量显著提升，为新生儿消化道提供免疫收益[38]。IgA包括IgA1和IgA2亚型，其分子中均含有多个糖基化位点[39]，呈现高度异质性[40]。IgA2亚型中，轻、重链之间可不以二硫键连接，且2种异性体中IgA2m(1)的2条轻链之间可直接形成二硫键[41]，呈现复杂的复合物体系。

本课题组拟针对含有非共价亚基的IgA2抗体及其尺寸变异体(size variant)复合物体系，使用碎片互补法分析完整蛋白复合物。通过平行使用碎片互补法、针对全体蛋白型系综还原方法及针对蛋白型亚群有限还原方法的结果比较和交叉验证，对方法性能进行评价，并提出可显著提升准确性、有效避免错误鉴定的分析方案。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

使用Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪(美国Thermo Fisher公司产品)进行基于PTCR的质谱测定，使用Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole Orbitrap质谱仪(德国Thermo Fisher公司产品)进行其他质谱测定，仪器均配备静态纳升电喷雾离子源(nanoESI)；利用5424R台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司产品)进行溶液置换；采用DS-11+光谱仪(美国Denovix公司产品)测定蛋白样品浓度。

1.2 主要材料与试剂

单克隆血清IgA2m(1)抗体(IgA2单抗)：北京爱博生生物技术有限公司产品；乙酸三甲基铵(TEAA，色谱级)、间硝基苄醇(m-NBA，质谱级)：美国Sigma-Aldrich公司产品；醋酸铵(NH4Ac，色谱级)：阿拉丁(中国)公司产品；截留分子质量为50 ku的离心超滤套装：美国Merck Millipore公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1样品制备 利用离心过滤将抗体样品的原缓冲液置换为150 mmol/L醋酸铵溶液，制得浓溶液，以150 mmol/L醋酸铵溶液将蛋白浓溶液稀释至1～2 μmol/L。对于需进行系综还原的样品，将溶液中20%(mol/mol)的NH4Ac替换为TEAA，向需进行增电荷处理的样品溶液中加入1%m-NBA。

1.3.2质谱条件 使用静态纳升电喷雾离子源进样。离子传输管温度设为250 ℃。使用UHMR仪器测定时，分辨率设为50 000，检测范围设为m/z500～20 000。除特别说明外，串联质谱隔离窗口宽度均设置为m/z100；使用高纯氮气(纯度>99.99%)作为碰撞气，在不产生非共价碎裂的范围内调节碰撞能量。使用Eclipse仪器测定时，分辨率设为120 000，检测范围设为m/z350～8 000。除特别说明外，串联质谱隔离窗口宽度均设置为m/z100；PTCR使用仪器标配模块，在20～40 ms区间调节反应时间。

1.4 数据处理

使用Xcalibur、Biopharma Finder(Thermo Fisher Scientific)和Origin Pro(OriginLab，美国)软件处理质谱数据。

2 结果与讨论

2.1 IgA2单抗一级质谱测定的误差

IgA2m(1)单抗单体含由二硫键连接的2条轻链和2条重链，预期拓扑结构示于图1a，其2条重链中每条含4个N-糖基化位点，数量为常见IgG1抗体的4倍，呈现高度异质性。非变性条件下，高度糖基化蛋白不同价态的信号发生高度重叠，难以分辨[27]，且蛋白易发生凝集甚至沉淀，不适于进行完整糖蛋白分析。在常规非变性条件下，本工作使用的IgA2样品在一级质谱(MS1)中呈现明显区分的2簇信号：其中m/z较小的信号簇对应物种记为物种Ⅰ，另一簇信号对应物种记为物种Ⅱ。物种Ⅰ信号价态分辨率较高，其m/z分布范围略高于IgG1单体[27, 42]，示于图1b。考虑到IgA2链稍长于IgG1，且含有更多糖基链，每条糖基链的质量范围多在1～2 ku之间，IgA2单体的分子质量高于IgG1，物种Ⅰ的信号分布与对IgA2单体信号的预期相符。使用常规算法对2簇信号进行价态计算，可得将物种Ⅰ的价态+i指定为+24价，及物种Ⅱ的价态+j指定为+39价时，对应的残余(residual)偏差(σ)最低，此时计算所得的分子质量分别为147.8和359.4 ku，示于图1c。如前所述，IgA2单体的分子质量应略高于IgG1，而IgG1分子质量多在148～150 ku范围内，因此物种A的分子质量测定结果较预期偏小。由于此IgA2样品按经典表达纯化方法制备[43]，推测不含背景蛋白，且表达体系中不含J-chain成分，因而推测物种Ⅱ为物种Ⅰ的非J-chain连接二聚体。然而，物种Ⅱ的实测分子质量显著大于物种Ⅰ的2倍。上述相悖结果均表明，常规非变性条件下基于经典算法进行价态和分子质量测定的可靠性存疑。对此，可利用TEAA对样品进行系综还原，以提高价态分辨率、降低用于价态计算的m/z读数误差[27]。物种Ⅰ和Ⅱ的离子价态均显著降低，随着信号分布向高m/z端移动，二者的价态分辨率显著提升。使用经典算法计算价态所得结果为：物种Ⅰ的价态+i指定为+18价，及物种Ⅱ的价态+j指定为+28价，对应的分子质量分别为147.6和352.5 ku，示于图1d。分子质量测定结果与系综还原前接近，且仍然有悖于理论预期，表明价态分辨率的提升并不必然带来价态和分子质量测定准确性的提升。

注：+i和+j分别表示物种Ⅰ和Ⅱ价态计算的最高价态；分别以黑/蓝色及灰色标注偏差最小值数据点对应的分子质量数值及经后文所述方法测定价态对应的分子质量数值图1 IgA2m(1)的拓扑结构示意图(a)及IgA2单抗在常规非变性条件下(黑色)及系综还原条件下(蓝色)的MS1谱图(b)，使用经典算法对系综还原前后物种Ⅰ和物种Ⅱ进行价态计算所得的残余偏差分布(c，d)Fig.1 Schematics of the topologic structure of IgA2m(1) (a) and MS1 spectra of IgA2 mAb acquired under normal native condition (black) and ensemble reduction condition (blue) (b), plots of residuals corresponding to charge assignments using the classical approach for species Ⅰ and Ⅱ (c,d)

2.2 利用碰撞解离提升IgA2分子质量测定及尺寸变异体鉴定的准确性

针对IgA2复合物体系，利用基于CID或HCD将亚群有限还原方法及碎片互补策略进行整合。对糖蛋白复合物离子中分子质量分布较窄的一个亚群进行质量选择后碰撞解离，一方面可以将具有特定分子质量分布的大碎片从复合物中解离，碎片带走大量电荷的同时使残骸离子形成价态大幅降低的多个价态信号分布；另一方面，使母离子失去分子质量可忽略的单电荷小碎片，产生价态逐一递减的信号分布。质量选择操作减小了前体离子的蛋白型分布宽度，有利于降低谱图复杂程度、提高价态分辨率、减小用于价态计算的m/z读数误差，同时新生成的价态内，产物离子的质量分布均来自前体离子被分选出的分布较窄的亚群，因而可显著提升价态及分子质量测定的准确性。此外，碎裂反应的质量守恒可为分子质量计算提供更严格的约束条件，有利于提升准确性。将物种Ⅰ的单一价态(重新记为+i)内亚群经质量选择后进行HCD碎裂，获得2种碎片和相应的残骸产物示于图2a。其中，较大的碎片分子质量分布较均一，分子质量为46.2 ku，可作为碎片互补法的强约束条件。这一分子质量也与IgA2轻链二聚体的理论分子质量相符，为非共价解离产物。较小的碎片分子质量分布较宽，呈现似糖基化蛋白离子的异质性分布特征，其平均分子质量为24.4 ku。由于IgA2内轻链更容易以非共价方式整体解离，该碎片应为重链经非共价键解离所得，异质性来源可能为重链上的糖基化，或非特异性碎裂位点的空间分布。由于重链内存在多个链内二硫键并且与结构域封装相对应，可检测到的碎片应为结构域之间短片段内断裂所得的单一结构域碎片。由于Fc结构域更长且糖基化位点更多，这些碎片的分子质量数值更接近重链的(CH+VH)结构域。这些碎片来自非共价解离且分子质量分布较宽，其对应的残骸分子质量碎片也产生较宽的分子质量分布，且有更大可能发生显著的中性丢失，因而24.4 ku的数值在碎片互补算法中仅能用作弱约束条件。平行比较上述2种碎片对应的测定结果有助于评价碎片互补法的适用条件。

当使用46.2 ku解离的约束条件时，分别以前体离子经有限还原所得的价态分布(+i系列)和相应残骸离子(分子质量记为M(r))的价态分布(+j系列)进行残余偏差分析，可得+i指定为25时，前体离子分子质量(记为M(p))偏差最小，M(p)为167.6 ku；相应地，+j指定为13时，残骸离子分子质量偏差最小，M(r)为122.9 ku；引入碎裂反应质量守恒关系构建矩阵，则仅当+i归属为25、+j归属为13时，残余亏损(记为ΔM)最小，价态计算结果相同，示于图2b。此时，物种Ⅰ的分子质量测定值为167.6 ku，符合对IgA2单体分子质量的预期。而当使用24.4 ku解离作为约束条件时，相应残骸离子最小残余偏差对应的价态(+j’系列)和分子质量分别为+18和136.3 ku，引入质量守恒关系矩阵后按最小ΔM指向的物种Ⅰ分子质量变为160.6 ku，示于图2c。这一数值与系综还原条件下任意价态归属所对应的分子质量均有4 ku以上的偏差，显著大于因去溶剂化等因素造成的分子质量偏移水平，表明这一价态归属不具有合理性。考虑到谱图中呈现的减电荷前体离子信号可能已包含中性碎裂丢失的贡献，此时如将MS1条件下的前体离子价态分布引入矩阵，则可将物种Ⅰ的分子质量定位至168.5 ku，与强约束条件下所得结果仅相差0.9 ku，示于图2d。

注：a图的插图表示碎片离子信号的放大谱图；对于前体离子、对应46.2 ku和24.4 ku碎片的残骸离子，分别以+i、+j及+j’表示价态计算的最高价态图2 IgA2单抗样品中物种Ⅰ的串联质谱图(质量选择窗口为m/z 6 680～6 780)(a)，以46.2 ku碎片为约束条件的价态计算矩阵(b)，以24.4 ku碎片为约束条件的价态计算矩阵(c)，以及以24.4 ku碎片为约束条件，并以物种Ⅰ的MS1价态分布取代前体离子MS2价态分布所得的价态计算矩阵(d)Fig.2 Tandem mass spectra of species I in IgA2 mAb sample (with a mass-selection window of m/z 6 680-6 780) (a), and the charge determination matrix using the 46.2 ku fragment as the constraint (b), the charge determination matrix using the 24.4 ku fragment as the constraint (c), and the charge determination matrix using the 24.4 ku fragment as the constraint, with the charge distribution of the precursor ions in MS2 replaced with that of species 1 ions in MS1

使用同样方式分析物种Ⅱ，经质量选择的亚群在HCD下仅解离出单一碎片，即分子质量分布均一的46.2 ku物种，与物种Ⅰ的主要碎片相同，示于图3a。此处未检测到共价解离产物，可能是由于物种Ⅱ分子质量较大，对于碰撞能量的耐受较强，因而仅优先发生所需能量较少的非共价解离。分别将前体离子及残骸离子的价态分布引入以46.2 ku碎片为约束条件的价态计算矩阵后，可得物种Ⅱ对应分子质量为337.4 ku时ΔM最小(绝对值低于0.5 ku)，示于图3b。结合物种Ⅰ的测定结果，337.4 ku的数值较单体分子质量167.6或168.5 ku的2倍分别相差2.2和0.4 ku，与IgA2二聚体的分子质量预期相符。对物种Ⅰ和物种Ⅱ的串联质谱分析表明，当碎片为特异性解离产物且分子质量分布较均一时，可作为强约束条件，在利用碎片互补法进行价态和分子质量测定时提供较高的准确度，结果稳定可靠。当碎片特异性较差、分子质量存在一定范围分布时，其作为约束条件的可靠性减弱，可能会造成价态误判和相应的分子质量误差。采用MS1谱图中的价态分布取代MS2谱图中前体离子的价态分布可在一定程度上弥补价态测定的偏差，但需以MS1谱图中充分的价态分离度为前提。将上述可靠性更高的分子质量结果代入系综还原条件下基于MS1所得的价态归属图，结果示于图1d。可见，虽然物种Ⅰ、Ⅱ经系综还原后的分子质量测定仍存在偏差，但相比于准确分子质量所对应的价态归属，价态偏差由还原前的3个及2个单位，减小至还原后的2个及1个单位，表明降低价态可对价态及分子质量测定的准确性提供收益，但仅通过MS1数据难以保证准确度的提升，仍需借助基于串联质谱的方案提升结果的可靠性。

2.3 利用基于质子转移的有限还原验证分子质量测定的准确性

基于PTCR的亚群有限还原法已被证明是测定完整糖蛋白分子质量准确性最高的方法[27]。为直接验证利用碎片互补法所得分子质量测定结果的准确性，采用基于PTCR反应的亚群有限还原法，以更高的准确度[27]平行测定IgA2的分子质量。由于IgA2在非变性条件下的单体信号已超过可提供PTCR功能的商品化仪器的检测范围，无法检测其还原产物信号。因此，首先利用增电荷试剂对样品信号进行提升价态、减小m/z的处理。然而，由于增电荷试剂m-NBA在一定程度上会产生破坏蛋白高级结构的作用[44]，引入1%m-NBA后，IgA2会发生解离，MS1谱图中主要呈现轻链二聚体(L2)、重链二聚体(H)及疑似重链碎片(FH)的信号，示于图4a。选取重链单一价态的2个亚群分布分别进行基于PTCR的有限还原，2个质量选择窗口(W1及W2)下的前体离子均产生了2个价态系列的还原产物，示于图4b。这是由于重链分子质量分布较宽、相邻价态离子的m/z分布发生重叠，且增电荷处理后信号重叠程度增大，因此，每个质量选择窗口下选择的前体离子均包括相邻2个价态蛋白型中低价态的低分子质量部分和高价态的高分子质量部分，体现了分子质量分布的边界。将2个价态系列所得的边界分子质量取平均值，可得系综平均分子质量。2个窗口下所得的重链系综平均分子质量分别为59.7和59.9 ku，取其平均值59.8 ku计，则2条重链与轻链二聚体的分子质量之和为165.8 ku。考虑到大复合物离子测定中的去溶剂化误差[45]，这一结果与基于碰撞解离的碎片互补法所得的IgA2单体及二聚体结果吻合较好(偏差超过相邻数值价态指认造成的分子质量偏差)，表明在碎片特异性较好的前提下，基于碰撞解离的碎片互补法足以提供充分的质量准确性。

注：a图中插图为碎片离子信号的放大谱图；对于前体离子及对应46.2 ku碎片的残骸离子，分别以+i及+j表示价态计算的最高价态图3 IgA2单抗样品中物种Ⅱ的串联质谱图(质量选择窗口为m/z 9 150～9 250)(a)以及以46.2 ku碎片为约束条件的价态计算矩阵(b)Fig.3 Tandem mass spectra of species Ⅱ in IgA2 mAb sample (with a mass-selection window of m/z 9 150-9 250) (a) and the charge determination matrix using the 46.2 ku fragment as the constraint (b)

注：a图中插图为重链单体离子的局部信号图，红、蓝阴影覆盖区域指示2个质量选择窗口W1和W2的范围；b中箭头所示为前体离子，还原所得的2个价态系列的信号峰分别标注其对应的价态和分子质量图4 IgA2单抗样品在增电荷条件下所得的M1谱图(a)以及经W1和W2选择所得亚群的PTCR还原谱图(b)Fig.4 MS1 spectra of IgA2 mAb acquired under super-charging condition (a) and PTCR spectra of subpopulations of the heavy chain proteoforms with windows W1 and W2 (b)

3 结论

本工作使用非变性质谱及串联质谱，在完整蛋白复合物层面表征了IgA2单抗样本中因高度糖基化导致的异质性蛋白型分布及尺寸变异体。针对因复杂糖基化导致的价态及分子质量测定偏差问题，对全部蛋白型进行系综价态还原可提供一定收益，但仅基于MS1数据难以保证准确性。利用串联质谱针对特定蛋白型亚群进行有限价态还原可提供更高的准确性。当不具备进行基于电子或质子转移的反应条件时，可采用基于碰撞解离的串联质谱结合碎片互补原理提升价态及分子质量测定的准确性，且准确性与碎片特异性和碎片分子质量均一性正相关。这一策略可为复杂糖蛋白复合物体系在完整层面的准确分析提供普适性的方案。

致谢：感谢北京爱博生生物技术有限公司(Absea)提供IgA2单抗样品；感谢昌平实验室质谱平台对本工作的支持。