非变性质谱相关技术的研究进展

谭聪睿，徐 伟

(北京理工大学生命学院，北京 100081)

几乎所有的生命活动都受到蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)和蛋白质-配体相互作用(PLIs)的调控。蛋白质的功能与其结构紧密相关，检测并表征蛋白质复合物结构，阐明蛋白质之间及其与其他分子之间的相互作用网络是从分子水平上理解生命过程的关键，因此，需要对蛋白质复合物的结构以及结合动力学和热力学进行研究。近年来，核磁共振(NMR)、X-射线晶体学(X-ray crystallography)和冷冻电镜(cryoEM)等结构生物学方法[1-2]能够提供蛋白质和蛋白质复合物的高分辨结构数据，但难以直接描述蛋白质组装动力学和热力学。对于圆二色谱(CD)、荧光共振能量转移(FRET)、表面等离子共振(SPR)及等温滴定量热法(ITC)等传统生物物理实验方法[2-3]，较高的样品纯度是获得可靠实验数据的基础。

质谱(MS)技术可以获得样品组成和化学计量等信息，在蛋白质复合物分析方面具有较大的应用潜力。非变性质谱(nMS)使用软电离技术，在接近生理pH值和温和的去溶条件下，可将部分由非共价弱结合的复合物从溶液中完整地转移到气相中[4]，获得化学计量、结合形式、热力学、动力学和复合物拓扑结构等信息[5-8]。检测速度快、灵敏度高和样品用量少的特点，使nMS成为表征蛋白质复合物和蛋白质相互作用的重要手段。

近年来，有报道[9-11]使用nMS阐明蛋白质复合物的结构，测定相互作用结合常数，推动了nMS在医药研究、疾病诊断等领域的发展。本文将介绍nMS的技术特点及近年来的研究进展，并展望未来的发展方向。

1 样品制备与纯化

样品制备首先需要纯化目标蛋白质或蛋白质复合物，通常是在细胞内过度表达，然后使用亲和标签进行纯化，同时也可以从植物或器官组织等天然来源中获得。但不同的纯化方案需要特定优化，以获得足够的蛋白质或蛋白质复合物用于进一步分析。在蛋白质复合物的样品制备过程中，会引入金属阳离子、无机离子、去垢剂、缓冲液等[12-13]干扰物质。在nMS实验前，需要对样品中的干扰物进行稀释或去除，再将纯化后的蛋白质复合物转移至与质谱兼容的挥发性盐溶液中，通常选择pH 6～8的醋酸铵水溶液以保留蛋白质复合物的天然构象[14]。

nMS样品制备的难点在于样品处理与质谱检测的联用，既要保留蛋白复合物的天然结构，又要制备与电喷雾质谱兼容的缓冲液。在线样品制备与纯化技术(如尺寸排阻色谱(SEC)[15]和疏水相互作用层析法(HIC)[16])的发展有助于nMS的高通量检测，并使其适用于检测更复杂的样品。最近，Sharon等[17]将过度表达的某种蛋白质的细胞直接在醋酸铵溶液中裂解，离心取上清液，然后进行nMS分析，显著减少了样品纯化步骤。

通过修改喷雾过程中的恒定喷雾电压，开发了多种技术以简化样品处理过程。黄光明课题组[18]以脉冲电压在喷针中感生的微电泳效应为基础，开发了适用于单步质谱分析蛋白的微电泳技术，无需或仅需简单的样品前处理即可实现直接原位分析活细胞内蛋白质和动态监测蛋白质-配体相互作用。此外，该技术通过减少离子化阶段中蛋白质与金属离子非特异性结合的干扰，揭示了天然状态下与细胞功能相关的蛋白质-金属离子相互作用[19]。张新荣课题组[20]在电喷雾电离过程中使用阶跃电压处理小体积样品，在高电压阶梯进行电泳分离，在低电压阶梯进行质谱检测，可以显著去除盐类等基质干扰，提高复杂基质小体积样品的质谱分析灵敏度。不需要预处理即可对尿液、泪液等复杂体系内的蛋白质进行非变性分析，实现了高通量和快速分析。

2 离子源技术

2.1 纳升电喷雾电离源

离子源将分析物完整地从液相转移至气相是nMS检测的前提和关键。电喷雾(ESI)过程需要依赖高温、助溶剂和有机酸等，不利于保留蛋白质复合物的天然结构[21]。纳升电喷雾电离源(nESI)[22]的出现极大地推动了质谱技术在蛋白质分析中的应用，其产生的液滴尺寸较小，可以使用水溶液和耐受较高的盐浓度，且所需的样品量较少。在此基础上，Wilm和Mann[23]于1994年设计了一种喷头尺寸更小的nESI源，将电喷雾喷头的直径从0.5 mm缩小至1～2 μm，通过减小初始液滴的尺寸，减少每个液滴中的盐离子数量，进一步减少溶剂挥发后蛋白质的盐类加合物，显著降低了对样品制备的要求[24]，示于图1。Susa等[25-27]基于这种小尺寸喷头nESI源的脱盐方法，实现了含干扰成分的缓冲液中蛋白质复合体甚至膜蛋白质的分析。

2.2 解吸电喷雾电离源

2004年，Cooks课题组[28]提出了解吸电喷雾电离源(DESI)，通过将电喷雾产生的带电液滴撞击样品表面产生携带样品的次级液滴进入质谱仪检测。DESI作为一种敞开式软电离技术基本不需要对样品进行预处理，其最重要的应用是质谱成像[29]，能够用于外科手术中肿瘤组织的实时检测[30]，此外，DESI也被成功应用于nMS研究。最近，Robinson课题组[31]使用DESI研究脂类和药物与膜蛋白的结合，展示了高通量筛选激动剂的潜力；Cooper课题组[32]将nano-DESI应用于nMS实验，实现了对组织样本中蛋白质及蛋白质复合物的成像，同时，该装置还能够用于定位的自上而下测序实验。目前，DESI用于非变性质谱作为结构生物学的重要工具已被广泛接受，该技术对完整膜蛋白及其复合物的研究能力为在人工双层膜或膜模拟物中进行空间、时间甚至定向分析提供了进一步的可能性。

图1 微米级和纳米级电喷雾喷头生成的带电液滴[24]Fig.1 Evolution of a charged droplet generated with microemitter and nanoemitter[24]

2.3 温控电喷雾电离源

图2 变温电喷雾电离源装置(vT-ESI)[39]Fig.2 Variable-temperature electrospray ionization (vT-ESI)[39]

温控电喷雾电离源(TCESI)通过控制喷雾溶液的温度，在喷雾前对溶液中的待测物进行加热或冷却，结合MS用于研究生物分子的热力学。相较于其他方法(如CD、ITC)，TCESI-MS能够以较低的样品消耗量提供更详细的结构信息，实现对复杂混合样品的检测分析[33]。将TCESI用于nMS能够直接测定蛋白质及其复合物的变性与非变性结构，以及蛋白质-配体相互作用的动力学和热力学[33]。目前，具有较宽工作温控范围的电离源包括温控纳升ESI[34-35]、冷喷雾ESI[36]、高压ESI[37]和双加热模块ESI[38]。在Robinson等[34]和Kaltashov等[35]研究溶菌酶、热休克蛋白TaHSP16.9和抗凝血酶的热致变性以及温度诱导的抗体构象转变的前期工作基础上，Russell等[39]开发了一种变温电喷雾电离源装置(vT-ESI)，示于图2。该装置利用热电芯片控制电喷雾溶液在-5～98 ℃温度范围内以小于2 min的平衡时间变化，与质谱及离子淌度谱相结合成功地用于研究蛋白折叠的热力学和温度依赖性配体结合过程。Zenobi课题组[38]开发了一种编程温控以及跳变温区电喷雾电离源(T-jump ESI)，能够在10～90 ℃温度范围内进行快速动力学实验(0.16～32 s)，并与质谱结合，对肽段、蛋白质以及DNA复合物进行折叠和展开动力学研究。

3 质量分析器

3.1 四极杆飞行时间质谱

在nMS实验中，质谱仪需要能够传输并准确识别具有较高质荷比的复合物，通常使用飞行时间(TOF)质谱和四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱。随着nMS的不断发展，需要对传统的Q-TOF进行改进[40]，降低四极杆的射频可传输具有更高质荷比的离子，增大压强可优化高质荷比离子的传输与去溶，示于图3。此外，通过优化碰撞活化室出入孔可传输前体离子和产物离子，减小碰撞活化室入口和出口孔径大小可允许更高的碰撞压力[40]。

3.2 轨道离子阱质谱

nMS中质量分析器的改进几乎都是基于TOF或Q-TOF，基于轨道离子阱(Orbitrap)[41](示于图4)和傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)的质谱仪也展现出在nMS分析中的潜力。2012年，为开发基于Obritrap的高分辨质谱仪，Rose等[42]改装了允许探测高达m/z24 000离子的软件，施加最大电压于所有传输高质量离子的射频多极，增加了高能碰撞解离室(HCD)的压力。后续对Q Exactive组合型四极杆-轨道阱质谱仪[43]和Q Exactive超高质量范围质谱仪[44]进行开发。

3.3 离子活化方法

在nMS实验中，串联质谱分析采用多种离子活化方法使蛋白质复合物的前体离子活化碎裂，形成1个带电的单体离子以及剩余亚基组成的蛋白质复合物，从而提供蛋白质复合物的结构和相互作用信息[8]。通常采用的离子活化方式是碰撞诱导解离(CID)[45]，碰撞气体将携带的部分能量通过碰撞转化为前体离子的内能，使前体离子解离产生产物离子。CID是几乎所有串联质谱平台的常规功能，至今仍是离子活化方法的金标准[46]，但CID会产生过多的重排反应，不利于获取复合物的四级结构[47]。表面诱导解离(SID)是一种颇具前景的活化方法，主要用于分解蛋白质复合物[48]，通过离子与固体表面碰撞，能够在结合力最弱的亚基处优先解离，保留剩余复合物的天然构象，从而表征蛋白质复合物的四级结构。此外，用于研究蛋白质复合物的离子活化方法还有：1) 基于电子的解离方法(如电子捕获解离(ECD)和电子转移解离(ETD))不会导致翻译后修饰的损失，可用于定位修饰的位点，已广泛用于肽和蛋白质的分析[49]；2) 用不同波长的激光代替碰撞气体为离子提供能量的解离方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)，其中UVPD产生碎片的途径广泛多样，具有范围较广的序列覆盖，被用于多种蛋白质组学研究[50]。以上离子活化方法均能够在蛋白质复合物的研究中保留复合物的非共价相互作用[51]，可用于在商用或改装的质谱仪上进行串联nMS分析[46]。

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图3 改进的Q-TOF质谱装置示意图[41]Fig.3 Schematic of a modified Q-TOF mass spectrometer[41]

图4 Q Exactive组合型四极杆-轨道阱质谱仪示意图[41]Fig.4 Schematic of Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer[41]

4 质谱联用技术

4.1 离子淌度质谱

近年来，离子淌度谱与高分辨质谱联用的离子淌度质谱(IM-MS)发展快速，已作为一种分析完整蛋白质复合物的技术被应用于nMS研究，获取蛋白质复合物高阶结构和相互作用动力学特征[52-53]。早期研究表明[54]，蛋白质复合物液相结构可以部分保留在气相中，其中一项关键的发现是观察到tRNA结合蛋白TRAP的环状结构能够保持在气相中[6]，证明了IM-MS应用于nMS研究蛋白质复合物结构的可行性。目前，用于IM-MS技术的有漂移时间离子迁移谱(DTIMS)、行波离子迁移谱(TWIMS)和捕集离子迁移谱(TIMS)、场不对称波形离子迁移谱(FAIMS)和差分电迁移率分析仪(DMA)等，其中DTIMS是最传统的方式，TIMS则代表了最新的技术。Dodds等[55]比较了上述5种迁移谱技术在结构和功能上的差异，示于图5。DTIMS、TWIMS和TIMS的迁移区均由环形电极组成，DTIMS在迁移区内施加均匀电场，是唯一能直接测定离子碰撞截面积(CCS)的技术；TWIMS在迁移区内施加振荡电场，显著提高了分辨率；TIMS在迁移区内施加缓慢降低的扫描电场与反向缓冲气流，实现了选择性地洗脱目标离子。FAIMS和DMA在平行极板间形成迁移区，迁移区内电场与缓冲气流方向相互垂直，FAIMS利用非对称射频高压叠加直流低压使非目标离子迁移至平行极板被中和，提高了目标离子的信噪比；DMA的检测电极分布在平行极板的一侧，离子根据迁移率在平行极板上进行分离，常用于大分子的检测。

质谱与IM的联用为nMS检测分析提供了离子横截面作为与MS正交的分离维度，由蛋白质和蛋白质复合物的漂移时间可获得对应的CCS信息，通过建模分析IM-MS实验数据，可以得到蛋白质复合物相对精细的结构模型作为额外的形状分析维度[56]。另外，IM与离子活化技术(如碰撞诱导展开(CIU)[57-59]、SID)相结合，可以提供更丰富的结构信息，用于配体影响蛋白质复合物构象稳定性的研究，如底物与辅助因子[59]或脂类与蛋白[60]结合的稳定性。

近年来，IM-MS在仪器、标准和方法建立等方面均取得了进展。Gadkari等[61]和Jeanne等[62]分别研发了商用DTIMS(示于图6)和TIMS仪器用于更大生物分子的非变性分析。Mortensen等[63]和Stiving等[64]提出了IM标准，并在有无校准剂的情况下通过TWIMS计算CCS，但对于不同IM仪器实验结果之间的比较，以及不同实验室的实验重复性和CCS计算结构之间比较的研究不足[65-66]。

IM-MS用于蛋白质复合物的nMS研究范围很广泛，从结构建模到功能性研究，其中最近颇受关注的是抗原表位测定，利用IM分离识别抗原表位复合物[67]或纤维和淀粉样蛋白的形成[68]。

4.2 毛细管电泳-质谱

毛细管电泳(CE)与质谱联用接口的发展[69-71]，使CE-nMS成为一种用于检测完整蛋白质和蛋白质复合物的有力工具[72]。一方面，常规CE与nMS联用可用于区分不同的蛋白质；另一方面，新开发的CE-nMS可用于测定蛋白质高阶结构信息。

图5 不同离子迁移谱的结构、加电方式及主要功能[55]Fig.5 Variations of IMS technology with representative descriptions of applied field and gas dynamics[55]

图6 用于nMS的安捷伦6560 DTIM-QTOF改装[61]Fig.6 Agilent 6560 DTIM-QTOF modified for native mass spectrometry[61]

1999年，He等[76]提出通过CZE-MS能够分离还原和氧化形式的细胞色素C，并进行准确的定量分析。Taverna等[77]将CZE-nMS应用于分离和表征抗凝血酶的各种构象，其中只有天然构象具有生物活性，因此，通过CZE-nMS将天然构象与其他构象分离，检测其他构象的存在，可以确定抗凝血酶药物的疗效。同时，有报道[79-80]应用CZE-nMS技术对治疗性单克隆抗体进行表征，并实现了其变体及聚合物的鉴定。最近，Jooß等[81]对如何获取高质量CZE-nMS数据给出了详细的教程以及优化的操作程序。

4.2.2淌度电泳-非变性质谱 2019年，本课题组[83]基于毛细管电泳和离子淌度提出了一种液相“IM”技术——淌度电泳 (MCE)。MCE使用压力驱动的恒流取代传统毛细管电泳的电渗流(EOF)作为驱动力，并施加与毛细管内形成层流场反向的分离电场，根据离子的有效电荷与流体动力学半径之比进行分离。

MCE-nMS联用技术能够提供新的分离维度，MCE可将泰勒扩散分析(TDA)和电动扩散(EKD)与毛细管电泳结合，实现了与蛋白质高阶结构相关参数(有效电荷与流体动力学半径)的测定[82,84-85]。研究表明[74-75]，质谱图中蛋白质的电荷态分布能够反映其溶剂可及表面积(SASA)和电喷雾电离前在溶液中的折叠构象，因此MCE-nMS还可用于测定液相中蛋白质的SASA。将MCE-nMS实验数据与蛋白质椭球近似结构的算法相结合，可以进一步得到蛋白质的三维形状和半径，示于图7。同时，实验数据还可作为分子动力学仿真的限制条件，用来预测蛋白质可能的构象[82,84-85]。与IM-nMS相比，MCE-nMS可直接在液相中测定蛋白质结构参数，其结果更能反映蛋白质的天然构象，有利于在近生理条件下研究蛋白质相互作用。

Zhang等[85]应用MCE-nMS监测了胰岛素二硫键还原过程，还原产物A链、B链和胰岛素通过MCE分离，随后进行nMS检测，计算得到三者的流体动力学半径，结合分子动力学仿真给出胰岛素还原后最可能的构象，验证了链内二硫键不易被还原。Wu等[82]引入了蛋白质3D椭球近似的理论与方法，进一步拓展了MCE-nMS表征蛋白质和蛋白质复合物高阶结构的能力，并测定其椭球模型尺寸，结果与蛋白质数据库(PDB)的晶体结构一致。MCE-nMS能通过测定结合常数和化学计量来表征蛋白质相互作用[86-88]。Hong等[89]探索了应用MCE-nMS研究蛋白质与配体结合的可行性，以三乙酰壳三糖与溶菌酶和细胞色素C的结合为例，测定了无结合蛋白质与蛋白质复合物的尺寸差异，并结合分子动力学仿真预测了蛋白质复合物最可能的构象。

图7 MCE-nMS表征球状蛋白质的椭球近似模型[82]Fig.7 MCE-nMS procedures to characterize the ellipsoid shape of a globular protein[82]

5 总结与展望

本文综述了近年来非变性质谱在仪器方面的突破。目前，nMS已成为研究蛋白质和蛋白质复合物的重要工具，除了能够提供基本的化学计量信息，还能够提供蛋白质复合物的拓扑结构、蛋白质相互作用信息。nMS可以研究其他方法难以表征的蛋白质复合物，或结合核磁共振、X-射线晶体学和冷冻电镜等技术对原表征不足的蛋白质复合物结构模型进行改进完善[90]。同时，nMS与IM的结合显著提高了研究蛋白质复合物构象的能力[6,54,91]，也为解释蛋白质复合物的液相天然结构特征能否在气相中保持不变这一问题提供了新思路。MCE技术能够直接在液相环境中获取蛋白质复合物的天然结构信息，其高效的分离能力与MS准确的测量能力相结合，极大地推动了nMS对蛋白质复合物和相互作用的研究。

尽管nMS取得了显著进展，但其发展仍面临较多挑战。在分析复杂样品时，某些蛋白质复合物需要高浓度添加物(如金属离子、脂类或其他与nMS不兼容的成分)来维持结构的完整性，且在繁琐的样品纯化过程中可能会造成蛋白质复合物的低亲和力或瞬时相互作用的丢失。比如在分析膜蛋白过程中，由于膜蛋白需要脂质环境或去垢剂才能在水溶液中保持可溶，这样的要求通常会影响膜蛋白的电离。近年来，通过质谱仪内的去垢剂胶束释放，能够对完整的蛋白质-脂类复合物进行检测并研究其相互作用[60]；得益于纳米尺寸nESI喷头的出现，使用nMS技术能够研究膜蛋白和配体的相互作用[92]。此外，进一步提高IM分辨率也是未来的挑战，这将有利于更好地分离和表征蛋白质复合体及亚基的不同构象，识别在质荷比维度重合的离子，用于监测动态非共价相互作用中微小的构象变化[53,59]。同时，提高nMS分析通量和易行性也是未来的研究方向。nMS作为研究蛋白质和蛋白质复合物的重要技术，连接并互补着结构生物学和蛋白质相互作用，有望将多种研究技术集成至单个仪器平台对同一样品进行多项技术检测。