非变性结构质谱在蛋白提取、离子源开发与构象解析方面的研究进展

许 霞，张晨傲，孙梓懿，郑 珍，李功玉,3

(1.南开大学化学学院，分析科学研究中心，天津市生物传感与分子识别重点实验室，天津 300071；2.天津医科大学药学院，天津 300070；3.物质绿色创造与制造海河实验室，天津 300192)

非变性条件下的蛋白质研究可以提供更具生物学意义的结构信息，为蛋白质“序列-结构-功能”关系提供分子基础，以此揭示标志物蛋白在人类疾病发展过程中的作用，从而为疾病的精准治疗提供潜在的药物靶点。非变性质谱兴起于20世纪90年代[1-3]，是一种使用特殊缓冲溶液(主要为醋酸铵)的蛋白质质谱分析技术。自2004年Leney等[4]首次提出非变性质谱(native mass spectrometry)概念至今，其已广泛应用于结构生物学、质谱分析、生物制药等领域，且起着不可替代的作用。

如何在分析蛋白质时使其保持近似自然生理环境中的非变性状态，一直是结构生物学领域研究的热点和难点。与X射线衍射晶体学、冷冻电镜等传统结构生物学手段相比，非变性质谱受益于质谱对分子质量的高分辨检测，其可在使用极少量蛋白非结晶样品的前提下，以超快的分析速度提供蛋白质相互作用的结合计量学和拓扑结构等信息。非变性质谱与离子淌度仪(ion mobility spectrometry)联用可以快速分析蛋白质的高级构象，用于蛋白质和多肽的自组装路径解析追踪与纤维化异质性分析等研究[5]。

非变性质谱分析时要求蛋白质尽量维持或者接近天然生理环境中的状态。因此，与传统的变性蛋白质质谱相比，非变性质谱可以在提供完整蛋白质分子质量信息的基础上，尽可能保存非共价相互作用和拓扑结构等信息。非变性质谱要得到具有生物学意义的蛋白质结构信息，需至少满足3个条件：1) 样品制备条件温和。在蛋白质离子化之前，尽可能通过控制溶液条件，如pH值、离子强度、缓冲液组成等参数，使处于非变性溶液中的蛋白质维持与正常生理条件下相近的折叠状态[4,6]；2) 离子源条件温和。蛋白质分子在离子化、相转换过程中，需使用温和的离子源种类，选取合适的离子化参数，尽可能维持蛋白质高级结构；3) 质谱仪条件温和。非变性条件下生成的蛋白质离子在仪器内部传输、分离和检测过程中，需要尽量减少高真空环境对高级结构的破坏作用，如使用低电压模式并减少采样时间。

本文将从蛋白提取、离子源开发以及蛋白构象解析新策略等3个方面，总结非变性结构质谱的研究现状，并从化学测量学角度展望非变性结构质谱的发展前景。

1 非变性质谱蛋白提取方法

1.1 传统的质谱分析蛋白质提取方法

蛋白质提取是蛋白质结构解析的第一步，也是决定蛋白质结构质谱解析成败的关键步骤。传统的蛋白质提取包括总蛋白提取、膜蛋白提取、细胞核蛋白提取等方面，基本原理是根据蛋白质的带电性、极性和亲疏水性等差异，设计特异性识别探针或色谱柱进行提取、富集与分离。目前常用的蛋白质纯化方法有超速离心法、选择性沉淀法、凝胶层析法和亲和层析法等[7-8]，示于图1a～1d。值得注意的是，对提取纯化后的蛋白质进行质谱分析前，需要交换到合适的缓冲溶液中(如一系列浓度梯度的醋酸铵溶液)，使蛋白质恢复到非变性状态。

1.2 基于萃取技术的蛋白提取方法

样品预处理对于非变性质谱来说十分重要，良好的样品预处理既可以维持蛋白质复合物内的非共价相互作用，又可以保持样品溶液与质谱分析的兼容性，提高离子化效率。为了有效地从细胞、组织或血液中提取完整蛋白质，通常会将表面活性剂加入缓冲液中，有利于提取常规方法不易得到的膜蛋白。由于传统的离子型表面活性剂会在离子化过程中产生离子抑制效应，极大地抑制蛋白质质谱信号，因此离子型表面活性剂的去除对于这些蛋白质样品的质谱分析至关重要。但传统的去除表面活性剂的方法往往不可避免地使蛋白质遭受损失甚至降解，制约了蛋白质提取效率的进一步提升。美国威斯康星大学麦迪逊分校Ge课题组[9]近年来开发了一种质谱兼容的光裂解阴离子表面活性剂——4-己基苯基偶氮磺酸盐，其能有效溶解蛋白质，蛋白提取性能与十二烷基硫酸钠(SDS)相当。同时，该表面活性剂可以通过紫外线照射快速降解，不会影响质谱检测，可用于自上而下的完整蛋白质组学分析。

注：a.超速离心法；b.选择性沉淀法；c.凝胶层析法；d.亲和层析法；e.液体表面萃取[14]；f.纳升解吸附电喷雾[14]；g.原位细胞蛋白提取质谱[13]图1 适用于结构质谱解析的蛋白提取纯化方法Fig.1 Native MS-compatible protein extraction and purification methods

除离线的蛋白质萃取提取方法，伯明翰大学Cooper课题组[10]利用液体表面萃取技术(liquid extraction surface analysis, LESA)从固体表面直接提取蛋白质复合物用于在线质谱分析，成功检测到细胞内的亲和素四聚体(～64 ku)、二硫化碳水解酶的八聚体(～190 ku)和十六聚体(～380 ku)、GroEL四聚体(～800 ku)以及AmtB膜蛋白三聚体等蛋白质复合物，证明该萃取方法具有较广泛的适用性，示于图1e。该课题组于2022年报道了一种纳升解吸附电喷雾离子源(nano-desorption electrospray ionization, nanoDESI)，通过表面蛋白萃取，初步实现了约200 μm空间分辨率的原位蛋白质及其复合物成像分析，示于图1f[11]。

1.3 原位蛋白分析

原位蛋白分析是指直接或仅需简单处理后即可对细胞、组织或器官进行目标蛋白质分析的策略，其不需要严格的蛋白质提取和样本制备过程，简化了蛋白质提取处理步骤，作为一种新的蛋白分析方法逐渐受到关注。2016年，中国科学技术大学Huang课题组[12]提出了一种原位质谱分析策略，可以直接识别活细胞内分子质量相对较小的蛋白质和蛋白质-金属离子复合物。有趣的是，该课题组在这项开创性的工作中发现了细胞内外金属蛋白与金属离子结合状态的显著差异。然而，由于配体、溶剂和其他细胞成分的大量非特异性结合，直接在细胞中识别更大的蛋白质和蛋白质/配体复合物仍然具有挑战性。随后，该课题组又提出了一种通用的一步质谱策略[13]，命名为“活细胞质谱”(In-cell MS)，该技术可用于直接从活细胞进行原位蛋白提取，并在毫秒级时间之后对提取的蛋白质及其复合物进行在线、实时鉴定和相互作用监测。作者利用该策略成功实现了分子质量4～44 ku的17种蛋白质和蛋白质复合物的原位检测，示于图1g。与此同时，Cooper课题组[11]利用LESA和nanoDESI技术从脑、肾、肝等组织中直接鉴定了8种内源蛋白质聚集体，成功表征了亚基组成化学计量学等信息，并实现了蛋白质复合物在非变性质谱条件下的初步成像分析。这些研究表明，原位质谱技术可以最大程度地还原细胞内蛋白质及其复合物的真实生理状态，有助于蛋白质结构和功能的研究。

2 非变性质谱的蛋白质离子化方法

2.1 传统蛋白质质谱离子源

目前，生物质谱分析常用的2种主要离子源是电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI)和基质辅助激光解吸离子源(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)。由于在MALDI基质中(通常是酸性和变性环境)保存大分子复合物并维持非变性结构的难度较大，其在非变性结构质谱领域的应用较少[15-16]。而ESI不需要使用额外基质，也可以不加激光和热量等，是目前最温和的离子源，也是非变性结构质谱的首选离子源。

在满足蛋白质非变性构象与四级结构兼容的条件下，ESI仍受到灵敏度和样品利用率等方面的制约。在传统ESI中，溶液流速较快(>1 μL/min)，管喷嘴直径较大，以致产生的初始液滴尺寸较大(往往大于25 μm)，需要喷嘴与取样口之间有足够长的距离以支持液滴完成向气相离子的演化[17]，形成的气相离子仅有少部分进入质谱被检测，导致浪费大量样品的同时，很多低丰度的蛋白质分子离子也在这一过程中丢失，使灵敏度降低。相比于常规电喷雾，纳升电喷雾(nanoelectrospray ionization, nESI)使用更小内径的喷针毛细管(1～5 μm)，喷雾流速可降至100 nL/min[18]，由此产生的液滴尺寸较小，离子化效率较高，一定程度上解决了离子抑制效应的问题，更有利于分析蛋白质等生物大分子。因此，nESI是目前非变性质谱领域最常用的离子化方法[4]。

2.2 新型高性能结构质谱离子源

在非变性质谱分析时，通常通过添加非挥发性高盐溶液的方式模拟细胞内环境，并稳定蛋白质和蛋白质复合物的天然结构，维持蛋白质-蛋白质、蛋白质-配体、酶-辅助因子的相互作用[19]。然而，复杂样品带来的基质效应会干扰分析物的质谱检测，产生离子抑制现象[20-22]，同时增加基线噪音，导致灵敏度显著降低[23]；难挥发盐会与蛋白质离子形成加合物，多种蛋白质-盐加合离子的产生使质谱信号分布变宽，蛋白质信号分布到多个离子峰上，降低了蛋白质和蛋白质复合物的信号强度、质量测量的准确性以及检测复合物中质量相近蛋白质翻译后修饰的能力[19]。为减少复杂样品分析时的离子抑制干扰，通常在非变性质谱分析前使用透析[24]、渗滤[25]、离子色谱[23]、液相色谱[26-29]、毛细管电泳[30-34]或固相微萃取[35-36]等方法离线去除非挥发性盐，提高质谱分析的灵敏度，减少基质干扰。但该过程相对繁琐，分离过程中对样品的稀释也使其不适合分析信号强度较低的样品，且对于离子色谱而言，蛋白质分析物与色谱柱之间的相互作用可能会导致蛋白质构象变化。因此，近年来一些实验室在纳升电喷雾的基础上进行改进，取得了一系列重要进展。

2.2.1感应纳升电喷雾 美国普渡大学Cooks课题组[37]开发的感应纳升电喷雾离子化(induced nanoESI, InESI)为蛋白质等生物大分子的高通量测定提供了新方法。它不仅减弱了基质效应，而且避免了电极和喷雾溶剂之间的物理接触，实现了蛋白质的高效检出。感应纳升电喷雾装置在喷雾毛细管外放置一平面电极并施加交流电，利用其诱导产生的感应电场产生溶液喷雾将分析物离子化，示于图2a。所施加的交流电可以使InESI中的溶液喷雾交替生成正、负离子，对基质效应有较强的耐受性，电离效率高，喷雾毛细管不易堵塞，可以在没有任何预处理的情况下分析蛋白质样品，使复杂样品的高通量分析成为可能[38]。

2.2.2梯度电压纳升电喷雾 清华大学Zhang课题组[39]提出的梯度电压纳升电喷雾(step-voltage nano electrospray ionization method, SV-nano-ESI)可显著消除微量样品分析中的基质干扰，示于图2b。在发射器的尖端区域，可通过离子电迁移实现分析物和基质之间的有效分离。在2.4 kV电压下分析样品，强电场使基质中的阳离子与阴离子在尖端区迅速向相反方向迁移形成前导带和拖尾带，由于目标蛋白质具有较低的电迁移率，几乎保持在中间条带，从而实现目标分析物在不受基质干扰的情况下获得较高的信噪比。SV-nano-ESI施加在喷雾毛细管上的高压是去除基质的关键因素，该电压必须高于发生分离的临界电压，基质去除率与高电压的持续时间(即放电时间)高度相关。因此，通过控制电压与放电时间，可以实现蛋白质分析物与复杂基质的分离。SV-nano-ESI将分离过程与离子化过程相结合，不需预处理即可实现微量样品的高通量快速分析。

注：a,b.感应纳升电喷雾电离[38]与梯度电压纳升电喷雾法[39]装置示意图(改变对nESI的施加电压)；c.亚微米喷针的脱盐效应[19](减小nESI尖端尺寸)；d.纸喷雾离子化法[62]图2 新型非变性结构质谱离子源Fig.2 Emerging ion sources for native mass spectrometry

2.2.3亚微米电喷雾 加州大学伯克利分校Williams课题组[19]使用尺寸更小的喷雾毛细管尖端，即亚微米电喷雾，更好地分辨了蛋白质的电荷态分布，降低了盐加合离子峰的丰度，示于图2c。相较于尖端直径大于1 μm的传统喷针，尖端直径0.5 μm的亚微米喷针在电喷雾过程中产生的初始液滴更小，含有的蛋白质数目不多于1个。他们发现液滴中含有的盐离子随液滴尺寸的缩小而减少，当液滴含有少于1个蛋白质分子时，每个含有蛋白质分子的液滴中盐与蛋白质的比例降低，大部分盐离子被包裹在不包含蛋白质分子的液滴中。通过产生低盐含量的初始液滴和在尖端处施加高强度电场，亚微米喷针可降低盐离子的加合，直接从各种常用的高浓度非挥发性盐缓冲液中分析蛋白质和蛋白质复合物，节省了离线脱盐等样品预处理步骤。普渡大学Cooks课题组和新罕布什尔大学Li课题组[40-41]使用亚微米喷针分别开发了流速低至pL/min和fL/min(<10 pL/min)的电喷雾离子化方法。

2.2.4解吸电喷雾 普渡大学Cooks课题组[42-43]开发的解吸电喷雾离子源(desorption electrospray ionization, DESI)技术无需样品前处理和预分离即可实现质谱采样分析。 DESI实验中，表面分子的提取和去溶剂化的时间极短，在小分子分析领域取得了较广泛的应用，但由于萃取效率等原因，在复杂表面提取蛋白质进行质谱分析的应用较少。2017年，剑桥大学Robinson课题组[44]通过移除离子转移管使DESI可直接定位于质谱采样锥下方，完成了第一个完整蛋白质复合物的DESI分析，初步尝试了DESI针对水溶性蛋白和膜蛋白及其复合物的天然结构分析方面的应用。随后，帝国理工大学Bunch课题组[45]使用DESI检测出了完整的血红蛋白。

在传统DESI实验中，液滴和气体会与样品发生碰撞，利用溶剂与分析物的溅射实现离子解吸附，但不定向的溅射会导致检测效率降低。因此，Laskin课题组[46]提出了nanoDESI技术，使用自吸毛细管替代原有的气路辅助解吸方法，有效消除离子飞溅，提高采样效率。

2.3 非变性高气压电喷雾产生超电荷离子

由于大部分质量分析器对质荷比响应灵敏度呈指数级反比关系，因此提高蛋白质分析物的电荷态可以提升质量分析器的检测效率[47]，加深对非变性蛋白质离子气相结构的理解，优化基于电子或碰撞的离子活化方法中的解离效率、碎片离子数、序列覆盖率等[48-50]信息。电喷雾中高压气流的引入可以产生极微小的喷雾液滴[51]，不仅可以提高样品的除盐效果，从总体上增加信号强度[52-55]，而且可以增加高电荷态离子的信号强度[56]，提高蛋白质离子的电荷态。中山大学Li课题组[57]应用这一原理，使用高气压电喷雾(high-pressure ESI)产生了最高电荷态超过瑞利极限的超电荷离子。通过非变性质谱和离子淌度碰撞截面积(collision cross-section, CCS)测定，证实高气压电喷雾在蛋白结构分析时的优势。与固定电荷基团化学衍生化[58]、亚微米喷射尖端[59]、超电荷试剂[60-61]等提高电荷态的方法相比，高气压电喷雾是一种快捷简单且可控的超电荷方法。

2.4 纸喷雾用于非共价蛋白质复合物离子化

纸喷雾离子化(paper spray ionization, PS)是2010年由普渡大学Cooks课题组提出[62]，是一种迅速直接的敞开式离子化方法，兼具ESI与敞开式离子化方法的特点，其原理是将样品溶液点样于纸上，然后对湿润的纸张施加高电压产生离子，示于图2d。俄亥俄州立大学Wysocki课题组[63]将PS应用于非共价蛋白复合物的质谱分析，观察到PS产生了与nESI相似的质谱图，初步表明其可以保存蛋白质分析物中的非共价作用；进一步的离子淌度质谱实验提供的CCS数据也证明了其非变性质谱的兼容性，表明PS具有作为蛋白复合物非变性质谱分析离子化方法的潜力。

3 蛋白质构象的结构质谱解析

3.1 基于离子淌度质谱的蛋白质结构分析方法

离子淌度质谱(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)整合了离子淌度仪对离子进行尺寸和形貌分离以及质谱对分子质量和电荷进行分离的优势，根据离子淌度仪中离子漂移时间的长短区分不同离子，可以实现对相同质荷比(m/z)离子的二维构象分离分析。通过整合漂移时间与物理模型可计算蛋白质离子的CCS，用于定量描述蛋白质离子的大小与形状。离子淌度与质谱的联用使蛋白质离子的分析增加了反映离子尺寸与形状的CCS这一维度，实现在相同m/z下分辨同一蛋白质离子的不同折叠状态、蛋白质聚集体的不同聚集状态等，提供了更丰富的气相蛋白质离子结构信息。

非变性离子淌度质谱呈现的是蛋白质离子的静态构象信息。受限于仪器分辨率，蛋白质的微小差异构象在多种商业化仪器上往往无法实现有效分辨。鉴于此，开发了一种动态蛋白构象分析方法——碰撞诱导去折叠(collision-induced unfolding, CIU)，即在离子淌度分析器前增加碰撞激发池，在电场加速作用下，蛋白质离子在碰撞激发池与惰性气体发生碰撞，蛋白质的动能转化为内能而被激发，进而被诱导发生构象去折叠过程。这种去折叠引起的构象变化可以用CCS表征，通过逐步提高碰撞能量，蛋白质不断去折叠，CCS逐步增大，结构不同的蛋白质离子会出现不同的特征去折叠反应路径，原本通过CCS无法区分的蛋白质构象，通过不同CIU路径可以进行有效分辨。因此，与单独CCS测量相比，基于CIU的非变性离子淌度结构质谱在具备捕获蛋白质动态结构能力的同时，还展示出更高的结构分辨率，可以用来比较特定残基、结构域和翻译后修饰对蛋白质结构和功能的影响[64-66]、评价特定蛋白质靶向的配体分子结合效果以开发蛋白质筛选工具[67]。

然而，由于电喷雾产生的蛋白质离子不可避免地存在一定宽度的电荷态分布[68-69]，传统的CIU在实际操作过程中为简化数据分析，常依赖于四极杆筛选，对单一电荷态离子进行分析。值得注意的是，一方面，溶液相的电荷态和气相的电荷态之间的关联性并不强；另一方面，不同电荷态的蛋白质离子往往会产生不同的去折叠路径，表现出不同的结构信息，所选取的单一电荷态并不一定能反映溶液相非变性结构信息。由于目前预测具有最接近非变性状态结构的蛋白质离子电荷态仍存在困难，任意指定单一电荷态离子的分析不可避免地会产生电荷偏差效应。综上，选择单一电荷态的CIU构象分析策略不能全面提供溶液相蛋白质的结构特征，为避免单一电荷态的电荷偏差效应，需要付出更多的时间成本以筛选目标电荷态或逐个收集所有电荷态的数据。因此，本课题组[70]提出一种针对CIU策略的改进方案，即非靶向构象解析，包含全离子构象去折叠技术(all ion unfolding, AIU)和全构象表征方案(CCS accumulation, CCSacc)。

图3 非靶向构象解析策略示意图[70]Fig.3 Schematic illustration of non-targeted conformational interrogation strategy[70]

非靶向构象快速、高通量解析的示意图示于图3，对比性地阐述了CIU与AIU数据采集及其可视化方式的差异流程图。其中，AIU技术不再依赖前级四极杆筛选离子，而是将所有的蛋白质离子全部引入碰撞池进行构象去折叠操控，并利用离子淌度质谱追踪所有电荷态下的去折叠路径。为进一步消除电荷偏差效应，在引入AIU操控技术的基础上，开发了一个全新的全构象表征参数CCSacc，即通过将不同电荷态离子的CCS按相对丰度累积，考虑不同电荷态下的构象贡献，组成一个能代表蛋白质全局结构的构象参数CCSacc。AIU技术与CCSacc全局构象表征的有机结合，助力蛋白质结构质谱分析从传统的低通量靶向分析发展成为新型的高通量非靶向构象解析。这种新型的非靶向构象分析不仅保留了每个电荷态所携带的静态构象及其动态变化信息，而且能够更全面地揭示从溶液到气相中所有蛋白的全局结构信息。数据证明，这种方法受ESI产生的电荷态分布变化影响更小，对于结构相似蛋白质，非靶向方法更能表征出其中的细微结构差异。非靶向的构象解析技术已经被用于蛋白质种属差异鉴定[70]和低丰度不稳定翻译后修饰的构效关系[71]，并有望用于更多蛋白质高级结构对比性研究。

3.2 溶液相构象分析手段——离子迁移电泳法

与上述气相分析方法相比，溶液相的构象分析方法是一种更直接表征蛋白质结构的手段，可以提供更真实可信的结构数据，获取与非变性质谱相对应的构象信息，二者相互印证。北京理工大学Xu课题组[72-75]基于传统电泳技术开发出全新的溶液相离子迁移电泳(mobility capillary electrophoresis, MCE)策略，尝试建立溶液相与气相蛋白质结构之间的关联。MCE保留了传统电泳方法的分离电场，具有一定的复杂样品分离能力，可以通过蛋白质离子的保留时间测定其等效带电量。在此基础上，MCE使用Laminar流取代传统电泳的电渗流，实现了高稳定性、精准可控的离子迁移；泰勒扩散分析的引入使蛋白质离子流体动力学半径的测定可以通过峰形分析实现。综上，MCE同时实现了复杂组分分离、离子等效带电量测定与离子流体动力学半径测定，但这些信息仍然无法反映蛋白质的立体形貌。

MCE与非变性质谱联用可以实现椭球状蛋白质三维结构的初步确定，示于图4[76-77]。通过对椭球状蛋白质进行简单建模可知，确定其三维形状即确定椭球的半径(a、b、c)；蛋白质离子在非变性质谱中表现出的电荷态分布反映了溶剂可及表面积(solvent accessible surface area, SASA)的大小，包含了半径a的信息；MCE实验提供的流体动力学半径Rh与蛋白质体积V可以确定半径b、c。综上，MCE与非变性质谱联用可以确定溶液相蛋白质离子的三维尺寸信息，以反映其折叠状态等构象信息。将上述设计成果应用于一系列长球状、扁平状蛋白质良好的三维形状测定，结果与标准数据库具有较好的一致性。

4 总结与展望

非变性质谱的出现使通过质谱手段在近似生理状态下分析蛋白质组成及变化成为现实，在蛋白质翻译后修饰、蛋白结构与功能、蛋白质非共价相互作用以及蛋白复合物的化学计量学研究中发挥着不可替代的作用。离子淌度技术的引入以及多种构象分析手段的开发使得非变性质谱在蛋白质高级结构分析方面有了新的应用前景，尤其是在局部细节结构解析技术及分子模拟技术的融合策略下，非变性结构质谱技术可辅助构建蛋白质高精度三维结构模型。

虽然非变性质谱研究已经取得了长足的进展，结构质谱领域仍面临挑战：1) 局限于离线检测，缺乏原位蛋白质结构信息。如目前大多数非变性质谱的分析对象都是重组蛋白或者表达纯化后的蛋白复合物体系，然而重组蛋白脱离了蛋白质发挥功能的原有天然生物环境，缺少天然翻译后修饰与伴侣分子，可能使相关结构解析信息失真[5，78]。这一问题的关键在于结构质谱环境兼容性，即质谱检测环境(要求中性、无非挥发性盐的缓冲体系)与蛋白生存的生物环境(多种不同pH值条件、高盐条件)之间的兼容性问题，本质原因在于结构质谱离子源的灵敏度不高。原位质谱技术的开发有望解决这一问题，将对蛋白质的分析从纯品发展到细胞及局部组织环境水平。Sharon课题组[78-80]在内源性蛋白复合物的非变性质谱检测方面做了重要工作。此外，马斯特里赫特大学Heeren课题组[81]开发的微通道板(microchannel plate)检测器技术与近些年商业化的电荷探测质谱(charge detection MS, CDMS)技术代表了结构质谱硬件的最新进展[82-83]。随着离子源和检测方法的不断提升和优化，非变性质谱技术将推动蛋白质功能性结构原位分析的进一步发展。2) 结构分辨率无法匹配其他结构生物学技术。本文聚焦的基于离子淌度的结构分析技术，目前折算的结构分辨率上很难突破10埃，显然无法满足结构生物学对于超高分辨的结构解析需求。已有报道将离子淌度结构质谱与非变性结构质谱领域其他结构表征手段如化学交联[84]、氢氘交换以及分子动力学模拟等技术相结合[85]，使结构质谱分辨率得到了有效提高，可以整合全局以及局部细节的结构信息，构建可靠的蛋白质动态结构模型。当然，结构分辨率的提升最终还是依赖于提升仪器硬件性能及对应的仪器应用方法，包括新型构象分辨离子淌度技术以及新型蛋白质结构化学探针等[86-88]。

注：a.MCE同时实现复杂样品分离、等效带电量测定、流体动力学半径测定[72,74]；b.MCE与native MS联用建立椭球状蛋白三维模型流程[76]图4 MCE测定蛋白结构的工作流程Fig.4 Workflow of MCE-based protein structure probing