“开口”与“不开口”黄鳝胃肠道微生物群落结构分析

单宇峰，马 帅，叶 可，祝东梅，郑菲菲

华中农业大学水产学院/ 水产养殖国家级实验教学示范中心，武汉 430070

黄鳝（Monopterus albus）隶属于硬骨鱼纲、合鳃目、合鳃科、黄鳝属，是我国重要的淡水特色名优养殖品种，具有较高的营养价值和药用价值。近年来黄鳝养殖规模不断扩大，集约化程度高，网箱养殖成为主要方式[1]。目前，鳝苗大多是从市场上收购的野生苗种，其习惯摄食小鱼小虾，黄鳝的摄食习性一旦固定之后很难改变[2]，在驯食过程中因缺乏适口饵料导致收获的鳝种不多，再加上受网箱中的温度变化、水质变化、饵料改变和药物刺激等因素的影响，鳝苗经常出现“不开口”的情况[3]，严重制约了黄鳝的养殖规模和产量。

研究表明，食物中的微生物与鱼类消化道微生物群落的形成紧密相关，同一种鱼摄食不同种类的食物也会造成鱼类肠道微生物群落结构和种类的差异[4-5]。鱼类肠道微生物与其形成共生关系，肠道微生物对鱼类的食物消化吸收、分解利用，甚至生长、摄食都有利[6-7]。目前，有学者探究分析鳝苗不吃食的原因[3]，但是具体的内因还没有相关研究，为探究黄鳝“不开口”的内在原因，本研究采用细菌16S rRNA 高通量测序技术比较分析网箱投喂鱼浆养殖模式下“开口”与“不开口”黄鳝胃肠道的微生物组成和群落结构特征差异，旨在为鳝苗的驯食及健康养殖提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）仪器与试剂。①仪器：Nanodrop NC2000；SynergyHTX 型酶标仪；Legend Micro 21 型高速离心机；1795 型微型离心机；BC/BD-629HK 型卧式冷藏冷冻转换柜；HYC-360 型4 ℃冰箱；G560E 型振荡器；9902 型96 well PCR 仪；5424EQ766751 型24 孔离心机；DYY-6C 型电泳仪；BSC-1300 型无菌操作台。

②试剂：KOD FX Neo（TOYOBO）扩增聚合酶，购于美国NEB 公司；DNA 抽提试剂盒，购于美国Omega Bio-Tek 公司；DNA 胶回收试剂盒购于美国Monarch 公司。

2）样品采集。随机选取仙桃市西流河镇网箱投喂鱼浆养殖模式下“开口”和“不开口”的黄鳝各3尾，“开口”黄鳝体重为（110.43±23.46）g，“不开口”黄鳝体重为（30.25±7.40）g。用MS222 麻醉后，用75%乙醇擦拭黄鳝体表消毒，迅速在无菌操作台内解剖，按组织特点分别取黄鳝的胃和肠道[8]，3 尾黄鳝的相同组织放入2 mL 冻存管中混为1 个样本，以减少个体差异的影响。样品取好后迅速放于液氮中冻存备用。胃编号为CX，肠道编号为CY；“开口”组、“不开口”组黄鳝样品编号分别为S、T。

1.2 DNA 提取和PCR 扩增

用DNA 提取试剂盒提取黄鳝胃、肠微生物总DNA，用Nanodrop 定量DNA，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量。

两步建库法：第一步以DNA 为模板，设计带接头的引物进行PCR，第二步以第一步的PCR 产物为模板进行PCR。用16S rRNA V3-4 区通用引物（338F：5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3＇，806R：5＇-G GACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇）进行目标区域PCR 扩增；扩增体系（30 μL）：基因组DNA（50 ±10） ng、338F （10 μmol/L）0.9 μL、806R（10 μmol/L）0.9 μL、KOD FX Neo Buffer 15 μL、dNTP （2 mmol/L each）6 μL、KOD FX Neo 0.6 μL、ddH2O 补至30 μL；PCR 程序：98 ℃2 min，98 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃60 s，30 个循环；72 ℃5 min，4 ℃直到停止。Solexa PCR（20 μL 体系）：目的区域PCR 纯化产物5 μL、2 μmol/L MPPI-a 2.5 μL、2 μmol/L MPPI-b 2.5 μL、2×Q5 HF MM 10 μL，反应条件：98 ℃30 s，98 ℃10 s，65 ℃30 s，72 ℃ 30 s，10 个循环；72 ℃ 30 s；72 ℃5 min；1.8%的琼脂糖凝胶，电压120 V，40 min；将PCR 产物根据电泳定量（ImageJ 软件）结果，按照质量比1∶1 进行混样；混样后，采用OMEGA DNA 纯化柱进行过柱纯化；1.8%的琼脂糖凝胶，120 V 40 min 电泳后，切目的片段并回收；构建好的文库使用illumina Novaseq6000 PE250 测序。

1.3 测序数据分析

将测序数据进行处理后利用USEARCH version 10.0 软件在相似性97%的水平上对序列进行OTU 分析；再利用R 语言工具绘制稀释性曲线图、Venn 图、群落结构图和热图；使用QIIME2 软件对样品Alpha 多样性指数进行评估，分析样品间物种多样性；使用QIIME 软件进行PCA 分析，比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。

2 结果与分析

2.1 样品测序质量分析

基于Illumina Novaseq 测序及数据预处理共获得741 382 条有效序列；以97%相似性水平为标准划分各样品的可操作分类单元（OTU）数量（表1）。利用已测得的rDNA 序列中已知的各OTU 相对比例与其相对应的OTU 数量的期望值来构建稀释性曲线，各样品曲线都达到平台期（图1），说明随着测序深度的增加，测序量达到饱和且测序质量比较好、数据量合理，测序的深度基本能够覆盖样品中的所有物种。

2.2 Alpha 多样性分析

根据“开口”和“不开口”黄鳝胃肠道微生物OTU 数量，进行Alpha 指数分析。通过覆盖率（coverage）来评估抽样的完整性，本研究中各样品OTUs 的覆盖率是99.98%～100%，说明各样品中的全部微生物种类几乎都被检测到（表1）。OTU、Chao1 和ACE 表征丰富度，数值越高，表明群落的总数越高（即丰富度越高）；Shannon 和Simpson 指数表征物种多样性，数值越高，表明群落的多样性越高。结果表明，“不开口”黄鳝胃中微生物群落丰富度和多样性都较高，“开口”黄鳝肠道中微生物群落丰富度和多样性都较高。

2.3 Venn 图分析

为进一步分析“开口”与“不开口”黄鳝微生物群落组成的差异，根据样品的OTU 数量绘制Venn图。如图2 所示，“开口”组黄鳝胃的OTU 数量为186 个，肠道的OTU 数量为322 个；“不开口”黄鳝胃的OTU 数量为311 个，肠道的OTU 数量为217个，这说明各试验组黄鳝微生物在OUT 水平上具有一定差异。各试验组共有的OTU 数量为65 个，各样品特有的OTU 数量分别为44、88、76、42 个，分别占各自所有OTU 总数的23.66%、27.33%、24.44%、19.35%。

2.4 PCA 分析

PCA 分析可以反映样品的差异和距离，样品间距离越近，则表示这2 个样品的组成越相似。试验结果显示，4 组黄鳝肠道与胃中的微生物组成相差甚远，即均存在显著性差异（图3）。

2.5 肠道微生物群落结构和组成分析

样品中所有OUT 经物种注释，在门和属的水平分析不同组别的优势菌种。图4 为门水平上微生物的相对丰度，“开口”与“不开口”黄鳝的胃肠道微生物主要由厚壁菌门、变形菌门以及拟杆菌门组成，优势菌均是厚壁菌门，但菌群比例存在差异。与“开口”组相比，“不开口”黄鳝的胃中厚壁菌门比例减少，变形菌门比例增加；与“开口”组相比，“不开口”黄鳝的肠道中变形菌门显著减少，拟杆菌门显著增加。

图5 为属水平上微生物的相对丰度，4 个组别中优势菌群均差异显著。就黄鳝胃而言，“开口”黄鳝优势菌群为瘤胃球菌属和霍尔德曼氏菌属，其占比分别为24.89%、18.30%；而“不开口”黄鳝的优势菌群为粪杆菌属和罗氏菌属，其占比分别为26.85%、15.27%。就黄鳝的肠道而言，“开口”黄鳝优势菌群为埃希氏菌属和丹毒梭菌属，分别占细菌总数的16.45%、17.46%；而“不开口”黄鳝的优势菌群为另枝菌属与瘤胃球菌属，分别占细菌总数的19.61%、12.72%。

2.6 热图分析

对黄鳝胃肠道微生物在属水平上进行聚类式热图分析，由图6 可以看出，4 组样品中黄鳝胃肠道微生物主要聚为两大分支，“开口”黄鳝的胃和“不开口”黄鳝肠道样品聚为一支，“不开口”黄鳝的胃和“开口”黄鳝肠道样品聚为一支。

“开口”黄鳝胃中的小杆菌属、霍尔德曼氏菌、瘤胃菌属丰度显著高于其他组；韦荣氏球菌属、埃希氏菌属、丹毒梭菌属和链球菌属在“开口”黄鳝肠道丰度较高。而“不开口”黄鳝的胃丰度较高的菌群为不动杆菌属、克雷伯氏菌、毛螺菌属和罗氏菌属。就黄鳝的肠道而言，“不开口”黄鳝肠道丰度较高的菌群为另枝菌属和瘤胃球菌属。

3 讨 论

鱼类的肠道微生物菌落多样性对于鱼类自身的机体免疫力、抵抗病害、营养吸收和消化等有重要影响[9]。本研究采用了细菌16S rRNA 高通量测序技术分析“开口”和“不开口”黄鳝的胃和肠道的微生物的结构组成，研究结果显示“开口”和“不开口”2 种情况下特有的OTU 数量多，说明这2 种情况下黄鳝肠道的细菌群落组成存在一定的差异。有研究表明，鱼类肠道不同部位菌群结构不同，并且食物的改变会对鱼类肠道微生物菌群产生快速而显著的影响[10]。本文分析“开口”和“不开口”黄鳝胃和肠道的细菌群落和肠道微生物多样性发现，对于胃而言，“不开口”黄鳝的胃微生物菌落丰度和物种多样性都较高。但由于胃只有较强的消化能力，而无吸收细胞分布[8]，所以即使“不开口”黄鳝胃中微生物菌落丰度和物种多样性都较高但依旧无法吸收营养，导致个体较小。对于肠道来说，“开口”黄鳝的肠道微生物菌落丰度和物种多样性都高于“不开口”黄鳝。黄鳝胃和肠道微生物多样性和丰度存在一定差异，可能是由于胃和肠道的组织结构、消化酶活力等存在不同。胃有较强的消化能力，没有吸收细胞分布，黏膜层和肌层的厚度也比肠道薄，而肠道的吸收能力较强，并且其前后段组织也存在差异[8]。胃的蛋白酶和淀粉酶活力也比肠道更高，淀粉酶活力也随pH 值产生变化，胃的pH 值相比于肠道偏酸，因此酶活力也不同[11]。黄鳝胃和肠道微生物的多样性和丰度差异可能受这些因素的综合影响。

本试验研究发现，“开口”与“不开口”黄鳝的胃和肠道微生物主要由厚壁菌门、变形菌门以及拟杆菌门3 种类群组成，以往研究也表明厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门是鱼类肠道微生物中常见的优势菌群[12]。相比于“开口”黄鳝，“不开口”黄鳝胃中变形菌门、拟杆菌门比例均呈现上升趋势，而厚壁菌门的比例则呈下降趋势。就黄鳝的肠道而言，“不开口”黄鳝中厚壁菌门与变形菌门的比例相比于“开口”黄鳝都有所减少，而拟杆菌门的比例则上升。各组的具体优势菌群也存在差异，经分析发现“开口”黄鳝胃中的厚壁菌门和广古菌门的丰度显著高于“不开口”黄鳝。“不开口”黄鳝的胃中丰度较高的菌群为疣微菌门。研究表明，肠道中的厚壁菌门对多糖水解和糖类转运有着极重要的作用[13]。

由热图可知在属的水平上，“开口”黄鳝胃中的小杆菌属、霍尔德曼氏菌属丰度显著高于其他组别。韦荣氏球菌属、埃希氏菌属、丹毒梭菌属和链球菌属在“开口”黄鳝肠道丰度较高。这与属水平上微生物相对丰度柱状图基本一致。致病菌的比例较高，说明鱼浆投喂的黄鳝患病风险较高。“不开口”黄鳝的胃丰度较高的菌群为毛螺菌属和罗氏菌属。有研究显示，肠道内毛螺菌属和罗氏菌属数量增多与肠道炎症密切相关[14]。因此，推测“不开口”的黄鳝因为长期“不开口”摄食导致肠道炎症。热图和相对丰度柱状图都显示“不开口”黄鳝肠道丰度较高的菌群为另枝菌属和瘤胃球菌属。资料显示，另枝菌属的失衡也与肠道炎症和病变相关[15]，而瘤胃球菌则与肝脏损伤有着紧密联系[16]。因此，推测黄鳝“不开口”可能会导致其胃和肠道内诸如毛螺菌属、罗氏菌属、另枝菌属和瘤胃球菌属等有害菌群失衡。

研究表明，水蚯蚓干品粗蛋白含量约为62%，必需氨基酸含量高达35%，是理想的“开口”饵料[3]。人工配合饲料动物性原料所占比例越高，黄鳝鱼种培育规格越大，成活率越高，效果越好[17]。且在饲料中添加1.0%复方中草药对黄鳝生长、非特异性免疫、肠道消化酶活性及鱼体品质有明显的促进和改善作用[18]。也有研究表明，当饲料中甜菜碱添加量达到1.15～2.10 g/100 g 时，黄鳝生长率最高，饲料系数最低，肝脏脂肪含量较少，这与用动物性饵料养殖的效果基本接近[19-20]。另外，饲料中添加0.2%复合益生菌或投喂含有枯草芽孢杆菌益生菌都能在一定程度上提高黄鳝的免疫力，促进鱼体生长[21-22]；添加枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母菌复合益生菌还可改善黄鳝肝脏、胃及肠道的结构，提高肠道消化酶活力和抗氧化能力[23]。