添加补骨脂提取物的低敏处方粮对犬皮肤健康的影响

肖晓杰，丁明星，齐智利，胡曼丽，张 鑫*

1.赣南创新与转化医学研究院/ 心脑血管疾病防治教育部重点实验室/ 赣南医学院附属第一医院/ 赣南医学院，赣州 341000；2.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；3.华中农业大学动物科技学院，武汉 430070

作为人体最大的器官，皮肤是隔离宿主体内与外环境的第一道屏障，同时拥有丰富的免疫细胞网络，对于维持机体内环境稳态至关重要[1]。然而，皮肤问题已经给全球健康带来了巨大负担，皮肤病是造成非致命性损伤的重要原因之一[2]。作为人类伴侣的宠物，皮肤疾病也是头号健康问题，其中宠物瘙痒及皮炎最常见。特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种由多因素诱导的慢性复发性和炎症性皮肤病，临床表现以瘙痒为主，研究发现宠物AD 的临床、免疫学、组织学和病理学特征与人类相似[3]。随着我国宠物数量井喷式增长，AD 在宠物犬中的发病趋势不断增加，宠主在宠物皮炎及瘙痒等疾病防治方面承受较大的经济压力，开发有效的宠物皮肤修复药物和功能性食品具有重要的宠物临床意义和社会意义[4]。本研究自主研发了一款含有天然植物成分的犬低敏处方粮，为探究其对犬皮炎的防治调理效果，采用2, 4-二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）诱导建立犬AD 模型，探讨低敏处方粮对犬AD 的功效。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为15 只健康比格犬，年龄为8～10 月龄，12 h 明暗交替饲养，自由饮水，温度22～26 ℃适应性饲养1 个月。所有参加试验的犬均应通过一般身体检查和皮肤病学检查，被判断为健康且没有接受任何可能影响结果的药物治疗。定期采集血液样本进行评估，以确保犬的健康。所有的犬饲养在洁净环境中，并且在致敏之前未出现过敏性皮炎的临床症状。本试验经赣南医学院生物医学研究伦理委员会审批通过，所有动物操作均符合赣南医学院生物医学伦理委员会的操作指南。

1.2 试 剂

补骨脂提取物（西安瑞林生物科技有限公司），DNCB（安耐吉化学），无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），伊红（BASO），苏木素（谷歌生物）。对照组日粮为试验犬全价配合粮，犬低敏处方粮由赣南创新与转化医学研究院和江西惠宠科技有限公司联合研发。

1.3 仪 器

血液分析检测仪（美国Abaxis），3110 全自动生化分析仪（日本，Hitachi），石蜡包埋机（德国Leica），脱水机（德国Leica），切片机（德国Leica），Micro 17R 高速离心机（美国Thermo）。

1.4 处方粮制备方法

低敏处方粮配方营养值确认流程：犬低敏处方粮的配方目标营养值设计参考国标《GB/T 31216-2014 全价宠物食品-犬粮》和美国饲料管理协会（AAFCO），针对宠物犬过敏机制和营养需求所制定；选择低致敏性、高蛋白、低脂肪原料进行配方制作，严格控制原料种类，减少过敏原，并保证所有原料和添加剂符合《饲料原料目录》《饲料添加剂目录》规定。

试验用犬低敏处方粮生产流程：使用粉碎机对大颗粒原料进行粉碎，过孔径为0.25 mm 筛后按配方进行称取，将物料加入混合机内搅拌均匀。调整膨化机的温度、进料速度、转刀速度，进行膨化制粒。将挤压膨化后的颗粒物料放置于烘干机中，60～70 ℃的条件下干燥3～4 h，使其水分含量降至5%～10%。将干燥好的犬粮装在真空包装袋内，将真空时间调整为6 s，使用真空包装机进行真空抽提包装。

1.5 动物模型

15 只比格犬随机分为3 组：对照组（n=5）、模型组（n=5）、补骨脂处方粮组（n=5）。所有犬每隔1 d在肩胛区皮肤中皮内接种 0.1 mL 0.1% DNCB，DNCB 用丙二酮溶解，共注射14 次。在完成最后1次注射2 周后，试验犬在腹部区域的皮肤上接受贴斑试验。犬腹部剃毛后，模型组及处方粮组犬进行5%的DNCB 乙醇贴片诱导皮炎模型，每只犬贴片8个，将贴片放置并固定于犬剃毛处，持续作用24 h，对照组贴8 片仅含无水乙醇的贴片。贴斑后，将处方粮组的犬粮更换为富含补骨脂的低敏处方粮，模型组和对照组继续喂食普通日粮。对照组和模型组每天09:00、15:00 进行2 次饲喂，饲喂量如表1 所示，持续喂养4 周。试验期间，记录每日饮食量。

表1 犬每日饲喂量

1.6 评价指标

1）临床检查。在试验前、贴斑前、试验终点进行体重评价。贴斑试验后每隔1 d 进行1 次临床检查，持续2 周。所有犬经过专业兽医进行的严格临床检查，主要对皮肤炎性病变程度以及犬瘙痒程度进行评分[5]。每天1 次，对贴斑部位皮肤进行宏观病变评分。四分制：0、1、2、3 分，所有观察到的病变都被拍照并描述其位置、特征和严重程度。评分标准如下：0，无明显反应；1 分，红斑；2 分，红斑、硬结或水肿（丘疹）；3 分，红斑伴起泡或反应更严重。每天2 次，间隔6 h，观察犬对瘙痒的行为表现，进行瘙痒程度评分，具体如下：0，没有瘙痒；1～2 分，轻度瘙痒；3～4 分，中度瘙痒；5 分，持续而剧烈的瘙痒。

2）血液学分析。于0 周-24 h（贴斑试验24 h后）和4 周（贴斑后4 周）采集血液进行血常规和血生化分析，血液样本由惠康动物检测（武汉）有限公司医学检验实验室检测分析。

3）皮肤组织取材分析。0 周-24 h 和4 周取少量皮肤样本，并对取材部位进行缝合。采集后立即将组织固定于10%福尔马林中，用于后期H＆E 染色。

4）Q-PCR 试验检测炎症因子表达。0 周-24 h和4 周取皮肤样本，样品液氮速冻后保存，用于RNA 提取及Q-PCR 检测分析。设计犬的炎症因子引物，分析处方粮组、模型组与对照组之间的基因表达差别，引物如下：白细胞介素6（IL-6），F：CTCCTGACCCAACCACAGAC R：TCCTGACCCAACCACAGAC R：GGAAATCCTCCAGACTCCGC；白细胞介素4 （IL-4），F：CCTCACAGCGAGAAACGACT，R：ATCTGCCGCAGTACAGTAGC；肿瘤坏死因子-α（Tnf-α）F：AAGAGCTCCCAAATGGCCTC，R：CTCAGCTTCGGGGTTTGCTA。

1.7 数据处理及统计学方法

应用SPSS 21.0 统计软件进行统计学比较，数据指标分析采用“平均值±标准差”表示，组间采用双尾t检验或Wilcoxon 秩和检验进行统计分析，P＜0.05 认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 低敏处方粮评价试验流程

如图1 所示，比格犬在接受0.1% DNCB 致敏后，模型组和处方粮组采用高浓度5% DNCB 进行贴斑诱导皮肤超敏反应，对照组只贴含对照溶剂的贴斑。贴斑后，对照组和模型组继续喂食普通日粮，处方粮组更换饲料为补骨脂处方粮，直至试验结束。

2.2 低敏处方粮成分含量

表2 为低敏处方粮各营养成分含量。

表2 低敏处方粮营养成分含量

2.3 低敏处方粮对犬皮炎模型的影响

1）低敏处方粮对皮炎模型犬体重的影响。在试验前、贴斑前及终末时间点进行犬体重评价，结果发现对照组、模型组、处方粮组组间体重均一，且不同时间点动物体重稳定，各组间无显著差异（表3）。

表3 试验动物体重 kg

2）低敏处方粮对犬皮炎模型血常规的影响。如表4，在试验前后分析犬血常规，处方粮喂养对犬血液指标改变不显著，也证实处方粮的安全性。

表4 0 周-24 h 与4 周各组血液学检测结果

3）低敏处方粮对犬皮炎模型血生化的影响。由表5 可知，与对照组及模型组相比，处方粮组0 周和4 周时大部分血生化指标，特别是肝肾功能指标均未见明显异常，结合整个试验中的体重变化，说明低敏处方粮对犬的生理指标无显著影响，进一步证实处方粮的安全性。

表5 0 周-24 h 和4 周各组血生化检测结果

4）低敏处方粮对犬皮炎模型炎症反应的影响。试验犬在贴斑后24 h 开始出现皮肤红肿、瘙痒等症状，且皮肤红肿处在贴斑后7 d 出现皮肤疱疹、大量渗出物等严重皮炎现象，而后逐渐出现结痂的皮炎症状。同模型组相比，低敏处方粮组犬在连续喂食5～7 d 后皮炎表现减轻，具体评价指标为皮炎病变评分（图2-a）以及皮肤瘙痒评分（图2-b）明显降低。

5）低敏处方粮对犬皮炎模型皮肤病理的影响。贴斑后24 h（0 周-24 h），与对照组相比，模型组与处方粮组皮肤出现病理结构改变，主要包括角质层不完整，颗粒层细胞排列不规则，真皮层炎性细胞浸润，主要以淋巴细胞为主。贴斑后4 周，模型组犬皮肤角质层显著增厚，表皮层增厚，炎性细胞浸润较之前减轻，处方粮喂养4 周后真皮层增厚及炎症细胞浸润情况有所改善（图3）。

6）低敏处方粮对犬皮炎模型炎症基因表达的影响。如图4 所示，与对照组比较，模型组犬皮肤组织中炎性因子的表达显著升高，处方粮喂食4 周后IL-4、IL-6、TNFα等炎症基因表达显著下调，说明处方粮喂养能改善皮肤组织的炎症反应，降低敏感性。

3 结 语

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种由多因素诱导的慢性复发性和炎症性皮肤病，临床表现以瘙痒为主，AD 是人类和宠物皮肤病中最常见的疾病[6]。目前认为，犬AD 受遗传和环境因素影响，是皮肤表皮屏障受损和对环境过敏原/抗原的异常免疫反应以及皮肤微生物组改变相互作用的结果[7]。犬AD 的进展与皮肤及循环淋巴细胞群的变化有关，在急性炎症中，促炎因子能诱导Th2 细胞反应，在慢性反应时，可以观察到CD4、CD8 细胞的改变而引起Th1/Th2 失衡[8]。当前，针对AD 往往采用包括皮肤屏障修复、抗炎、免疫治疗在内的多模式治疗，但相关治疗方案仍缺少有力的科研论证[9]。已有证据表明，富含有必需氨基酸、益生菌、益生元、酶解蛋白成分等的膳食补充剂对犬AD 具有保护作用[10]。有证据表明，口服益生菌在AD 患者中能起到积极作用，揭示了肠道-皮肤轴的存在，为AD 的预防及治疗提供思路[11]，提示饮食因素能够改变肠道微生物群而增强皮肤健康[12]，为皮肤健康问题的保护、预防和治疗提供了新思路。笔者所在课题组研发了一款低敏处方粮，原料上选择低敏且经过水解的蛋白，降低食物过敏发生率；其次，营养组成上采用易消化蛋白、适宜脂肪、低纤维、高能量浓度，减少犬猫采食量，减轻肠道负担；同时，添加不饱和脂肪酸，强化皮肤屏障，支持敏感犬猫的皮肤健康。在试验过程中，模型组和处方粮组每只试验犬的饲喂量都经过计算，保证满足每只犬的每日静止能量需求，在完全采食的情况下，模型组试验犬体重稍有降低，可能是炎症反应影响了肠胃功能。而处方粮组的犬体重未有下降，可能原因是试验粮选用了易消化的水解蛋白，通过调整高能量密度降低了采食量和肠道负担，并在此基础上添加不饱和脂肪酸和B 族维生素强化了肠道屏障，因此，能在同样满足能量需求的情况下保持体重。

补骨脂（Psoralea corylifoliaLinn.）是豆科植物补骨脂的成熟果实，是中医常用的药材，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗风湿等活性，临床上常用来治疗白癜风、牛皮癣等皮肤疾病[13-14]。补骨脂中主要含有香豆素、单萜酚、黄酮、苯并呋喃类等活性成分，其中补骨脂素（psoralen）属于其中的呋喃香豆素类化合物，能够调节Th1/Th2 淋巴细胞平衡，促进TNF-α、IL-6、IL-1β 释放，发挥显著的抗炎和免疫调节作用[15]。补骨脂作为常用的饲料植物类添加物，广泛用于兽用功能性饲料的开发[16]。本研究采用AD 犬模型，证实了含补骨脂低敏处方粮在长期喂食过程中对犬AD 的炎症症状具有明显的改善作用，提示基于营养学、抗炎、抗免疫等的食品开发具有较好的前景。