HPLC同时测定姜黄醒酒饮料中3种姜黄素含量

孔文茹，李菲菲，尤钰琳，王智璠，纪建波

（山东大学 药学院，山东 济南 250012）

姜黄（Curcumae Longae Rhizoma）是姜科植物姜黄（Curcuma longa L.）的干燥根茎，历版《中国药典》均收载其为常用中药，具有破血行气，通经止痛等功效，用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛[1]。姜黄主要含挥发油类和姜黄素类，在中药中属活血药。现代药理研究发现姜黄及其主要有效成分姜黄素（curcumin）具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、保护肝脏等多种药理活性[2]。因其具有低毒、副作用少等优点，常被用作一种天然的食品添加剂。

有研究报道，姜黄素能减轻四氯化碳诱导的肝损伤[3]；姜黄素还可通过调节线粒体功能障碍和抑制内质网应激减轻小鼠慢性酒精性肝损伤[4]，通过显著降低乙醇诱导的天门冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶水平对肝脏产生保护作用[5]。目前，很多醒酒饮料中加入了姜黄素，以减轻酒精对肝脏的损伤。

迄今已有许多方法用于姜黄中姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的定性和定量分析，比如高效液相色谱法（HPLC）[6-7]、毛细管电泳法[8-10]、超临界流体色谱[11]、液相-质谱联用法[12]、薄层色谱法[13]等。HPLC因分离效果好，灵敏度高，选择性好，重现性高，常用于姜黄素类化合物的含量测定。

本研究建立了HPLC定量分析醒酒饮料中姜黄素的方法，成功应用于市场中含姜黄素的醒酒饮料中姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的含量测定。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦公司，包括G1311B四元梯度泵，G1367E自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B二极管阵列检测器，Agilent色谱工作站）；Mettler AG135十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ5200DE数控超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

市售姜黄醒酒饮料（编号：JH-1～JH-5）；姜黄素对照品（批号：C12348612，含量：98 %，上海麦克林生化科技有限公司）；去甲氧基姜黄素对照品（批号： RP210303，含量：99.51 %，成都麦德生科技有限公司）；双去甲氧基姜黄素对照品（批号：F2122080，含量：98 %，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇，乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；甲酸（色谱纯，美国Mreda公司），水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取姜黄素对照品10.11 mg、去甲氧基姜黄素对照品9.91 mg、双去甲氧基姜黄素对照品10.01 mg，置于10 ml量瓶中，分别加甲醇定容至刻度，配制成浓度为1 mg/ml的姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液 精密吸取醒酒饮料2 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声提取30 min，冷至室温，取上清，经0.22 µm有机系滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 µm），连接C18保护柱（4.0 mm×3.0 mm，5 µm，Phenomenex）；流动相：乙腈（A），0.04 %甲酸水溶液（B），按表1梯度洗脱；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；检测波长为425 nm；进样量：5 µl。

表1 梯度洗脱程序

2.3 系统适用性试验

精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5 µl，分别注入高效液相色谱仪，按2.2项下色谱条件测定。结果供试品溶液中姜黄素、去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素在对照品色谱峰相应位置有色谱峰流出，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 对照品（A）和样品（B）的HPLC图谱

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察 精密吸取姜黄素、去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素对照品溶液各适量，加入甲醇，配制成浓度为250 µg/ml的混合对照品溶液，逐级稀释，配制成浓度为125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98 µg/ml的混合对照品溶液。其中姜黄素的线性实验采用浓度为250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95 µg/ml的混合对照品溶液，去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的线性实验采用浓度为125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98 µg/ml的混合对照品溶液。按2.2项下色谱条件分别进样5 µl，测定峰面积。以对照品浓度（µg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的回归方程、相关系数和线性范围，见表2。结果表明，姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素在各自的线性范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

表2 线性考察结果

2.4.2 精密度试验 按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件，连续进样6次，测得姜黄素、去甲基姜黄素、双去甲氧基姜黄素峰面积的RSD值分别为0.34 %，0.37 %，1.03 %，表明该方法精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，6，12，20，30 h按2.2项下色谱条件进样，测定峰面积，测得姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素峰面积的RSD值分别为0.23 %，0.32 %，0.44 %，表明供试品溶液在该条件下30 h内的稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 精密吸取姜黄醒酒饮料6份，每份2 ml，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样，测定峰面积，测得姜黄素、去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素的平均含量为19.71，2.65，0.28 mg，RSD值分别为0.83 %，0.90 %，0.67 %，表明该方法重复性良好。

2.4.5 检测限和定量限 取2.1.1项下混合对照品溶液适量，用甲醇溶液逐级稀释后进样分析，测得姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的检测限（S/N=3）分别为0.48，0.24，0.24 µg，定量限（S/N=10）分别为0.98，0.48，0.48 µg。

2.4.6 回收率试验 取已知含量（姜黄素386.1 µg/ml、去甲氧基姜黄素51.8 µg/ml、双去甲氧基姜黄素5.4 µg/ml）的姜黄醒酒饮料3份，每份2 ml，分别置于10 ml量瓶中，再分别加入1 mg/ml的对照品溶液适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样，测定含量，计算回收率，结果姜黄素、去甲氧基姜黄素及双去甲氧基姜黄素的平均加样回收率为92.67 %～106.77 %，RSD为1.10 %～2.65 %。表明该方法准确性良好，结果见表3。

表3 回收率试验结果（n=3）

2.4.7 样品含量测定 分别吸取不同品牌的姜黄醒酒饮料2 ml，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按拟定的含量测定方法测定样品中姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的含量。结果见表4。

表4 不同品牌姜黄醒酒饮料中3种姜黄素的含量测定结果（n=3）

3 结论

本研究建立了HPLC测定不同品牌姜黄醒酒饮料中姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素含量的方法，该方法准确、灵敏。通过不同品牌的姜黄醒酒饮料的含量测定结果可看出，姜黄醒酒饮料中姜黄素的添加量最多，双去甲氧基姜黄素的添加量很少甚至没有。