口蹄疫病毒抗体SPC-ELISA 定性检测与LPB-ELISA 定量检测方法的比较

蔡文博

（常州市金坛区动物疫病预防控制中心，江苏常州 213200）

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）感染猪、牛、羊等偶蹄动物引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，可造成巨大经济损失和社会影响。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须通报动物传染病，我国将其规定为一类动物疫病[1]。目前，我国仍是受FMD 危害较为严重的国家之一，主要流行O 型和A 型[2]。

FMD 是我国优先防治病种之一，对其控制与消灭需要借助科学的检测手段。目前，常用的FMDV 抗体检测方法主要有病毒中和试验（VNT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA 因在FMDV 抗体检测中具有敏感、特异、稳定、安全等特点而备受青睐[3]。其中，液相阻断ELISA（LPB-ELISA）是检测FMDV 的国际标准方法[4]，也是我国FMD 诊断技术国家标准中认可的检测方法。但该方法操作步骤繁琐，每块反应板检测数量少，试验所需时间长[1]。目前市面上有一种固相竞争ELISA（SPC-ELISA）抗体定性检测试剂盒，它不需要对样品进行梯度稀释，每块反应板的检测量由LPB-ELISA 的最多20 份增多至92 份，从而有效解决了ELISA 定量检测方法不适合大批量检测的问题，但其尚未列入国家检测标准。

近年来，基层畜牧兽医部门技术人员短缺是我国大多数地区普遍存在的问题。为减轻基层技术人员检测压力，需要一种操作简单、适合大批量快速检测的方法。为评价SPC-ELISA 定性检测试剂盒的检测性能，本研究以2022 年春季从常州市金坛区采集的300 份猪、牛、羊血液样本为试验对象，分别应用SPC-ELISA 定性和LPB-ELISA 定量检测方法同时进行O 型、A 型FMDV 抗体检测，并以国家标准方法LPB-ELISA检测结果作为参考标准，比较两种方法的符合率和一致性，以期为技术人员在实际工作中科学选择检测方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 血液样本

分两批次抽检常州市金坛区2 家规模猪场，其中一家免疫的是新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产的猪O 型、A 型FMDV 二价灭活苗，另一家免疫的是中农威特生物科技股份有限公司生产的猪O 型、A 型FMDV 二价灭活苗，每次每场采集30 份血样；分2 批次抽检 1 家规模牛场，免疫的是金宇保灵生物药品有限公司生产的O 型、A 型二价灭活苗，每次采集30 份血样；抽检2 家规模羊场，其中一家分2 批次采集，另一家采集1次，免疫的是中牧实业股份有限公司生产的O 型、A 型FMDV 二价灭活苗，每次每场采集30 份血样。另外，采集未免疫家畜血样30 份，作为阴性对照。共采集血液样本300 份。

1.2 检测试剂

O 型FMDV 抗体LPB-ELISA 检测试剂盒（批号：20210922101-5）、A 型FMDV 抗 体LPBELISA 检测试剂盒（批号：20210910103-1），购自兰州兽研生物科技有限公司；O 型FMDV 抗体SPC-ELISA 检测试剂盒（批号：TE210802）、A型FMDV 抗体 SPC-ELISA 检测试剂盒（批号：E211002-1），购自洛阳莱普生信息科技有限公司。试剂均在有效期内使用。

1.3 主要仪器

酶标仪（型号：iMark），购自Bio-Rad 公司；电热恒温培养箱（型号：DHP-420），购自常州峥嵘仪器有限公司；微量移液器，购自Eppendorf 公司。

1.4 检测方法

血样采集后，室温静置2 h，4 000 r/min 离心5 min，分离血清，-20 ℃冻存备用。分别应用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 对所有血清样品进行O型和A 型FMDV 抗体检测。

LPB-ELISA 选择20 份检测样品布局。在U型反应板的A1～10、E1～10 孔分别加入87.5 μL PBST 和12.5 μL 被检血清；B1～10、C1～10、D1～10、F1～10、G1～10、H1～10 各孔加入50.0 μL PBST，以50.0 μL/孔的量用PBST 2 倍连续稀释血清，A1～10 孔的血清样品稀释至D1～10 孔后弃掉50.0 μL，E1～10 孔的血清样品稀释至H1～10 孔后弃掉50.0 μL。被检血清即在第1～10 列从1:8 稀释至1:64；在第11 列阳性对照血清，从1:2（即A11 孔50.0 μL PBST 加50 μL 阳性对照血清）稀释至1:256；A12—B12 孔阴性对照，从1:2 稀释至1:4；E12—H12 孔为病毒抗原对照孔。试验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 结果判定

LPB-ELISA：牛羊抗体效价≥27，猪抗体效价≥26，判定为个体免疫合格，即为阳性，否则为阴性。

SPC-ELISA：O 型抗体S/N＜0.4，判定为抗体阴性，S/N≥0.4，判定为抗体阳性；A 型抗体S/N＜0.7，判定为抗体阴性，S/N≥0.7，判定为抗体阳性。

1.6 数据处理

应用统计软件GraphPad Prism 8 中的χ2检验进行差异显著性统计与分析。其中，P≤0.01为差异极显著，0.01 ＜P≤0.05 为差异显著，P＞0.05 为差异不显著。采用Kappa 统计量分析两种ELISA 检测方法的一致性[5]，Kappa 统计量一致性强度参考判断指标：将Kappa 值从大到小划分为6 个区段，分别代表一致性强弱程度。Kappa值＜0，为极差；0～0.2，为微弱；＞0.2～0.4，为弱；＞0.4～0.6，为中度；＞0.6～0.8，为高度；＞0.8～1.0，为极强[6]。应用公式（1）计算两种方法检测结果的符合率。

式中，P0为符合率，Aii为c×c表中主对角线上的实际值，N为总计数[5]。

2 结果与分析

2.1 O 型抗体检测

从表1 可以看出，应用SPC-ELISA 检测的O 型FMDV 抗体阳性率（88.15%）总体略高于LPB-ELISA（85.93%），但差异不显著（P＞0.05）。不同畜种两种检测方法所得结果有所区别，但差异不显著（P＞0.05）。其中：猪的SPCELISA 抗体阳性率（97.50%）高于LPB-ELISA（90.83%），牛的SPC-ELISA 抗体阳性率（93.33%）低于LPB-ELISA（96.67%），羊的二者相等，均为72.22%。两种方法检测阴性对照样品的O 型FMDV 抗体阳性率均为0。

表1 O 型FMDV 抗体LPB-ELISA与SPC-ELISA 检测结果

2.2 A 型抗体检测

从表2 可以看出，应用SPC-ELISA 检测的A型FMDV 抗体阳性率（85.56%）总体略高于LPBELISA（81.48%），但差异不显著（P＞0.05）。除两种方法检测羊A 型FMDV 抗体阳性率相同外，SPC-ELISA 检测猪和牛的抗体阳性率均高于LPBELISA，但差异不显著（P＞0.05）。两种方法检测阴性对照样品的A 型FMDV 抗体阳性率均为0。

表2 A 型FMDV 抗体LPB-ELISA与SPC-ELISA 检测结果

2.3 检测结果一致性比较

2.3.1 O 型抗体 根据表3 可以得出，两种方法的总符合率为94.81%[P0=（228+28）/270=0.948 1]；Kappa 值为0.8，表明一致性强度为高度。应用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 同时检测羊O型FMDV 抗体，两者的总符合率为100%[P0=（65+25）/90=1]，即为完全符合。

表3 O 型FMDV 抗体SPC-ELISA 与LPB-ELISA检测结果一致性比较 单位：份

2.3.2 A 型抗体 根据表4 可以得出，两种方法的总符合率为91.48%[P0=（214+33）/270=0.914 8]；Kappa 值为0.7，表明一致性强度为高度。应用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 检测羊A 型FMDV 抗体，两者的总符合率为100%[P0=（65+25）/90=1]，即为完全符合。

表4 A 型FMDV 抗体SPC-ELISA 与LPB-ELISA检测结果一致性比较 单位：份

3 讨论

LPB-ELISA 是国家标准中的FMDV 抗体定量检测方法，敏感性高、特异性强、重复性好，但操作繁琐、耗时长，对操作人员的技术水平要求较高，不适合基层大批量检测，多适用于科学研究、比对试验等有特殊需要或考察检测能力的场景。2018 年后，我国在《口蹄疫诊断技术》（GB/T 18935—2018）[7]和《2022 年国家动物疫病免疫技术指南》中均增加了SPC-ELISA 定量检测方法。SPC-ELISA 定量检测方法延续了LPB-ELISA 方法的优点[8]，而且特异性更高，结果更为稳定[9]，但仍未解决操作繁琐、检测通量少等问题。而SPCELISA 定性检测试剂盒，操作简便、用时短，1 块反应板同时能检测92 份血清样品，可大大提高检测效率，较适合于流行病学调查等的大批量检测以及基层兽医工作人员使用。SPC-ELISA 定性检测优势明显，但还不是国标中规定的检测方法。

为验证两种方法检测结果的符合度和一致性，便于检测人员根据具体情况选择一种更适合的方法，对2022 年春季采集的规模猪场、牛场、羊场共300 份血液样本，分别用LPB-ELISA 试剂盒和SPC-ELISA 定性检测试剂盒进行O 型、A 型FMDV 抗体测定，结果发现应用SPC-ELISA 检测O 型和A 型FMDV 抗体的阳性率均总体略高于LPB-ELISA，但差异不显著（P＞0.05），说明两种方法的阳性检出率相当。

本试验采用LPB-ELISA 和SPC-ELISA 测得的羊O 型、A 型FMDV 抗体总符合率均为100%，即完全符合，测得的阴性对照样品抗体阳性率均为0，也为完全符合。应用两种方法，对接种了不同厂家疫苗的不同畜种、不同免疫时段的血清，同时进行O、A 型FMDV 抗体检测，所得总符合率均在90%以上，Kappa 值均大于0.6，表现出高度一致，说明两种方法的检测结果符合程度高，一致性强。朱爱发[1]分别应用LPB-ELISA和SPC-ELISA定量、定性检测猪O 型FMDV 抗体，发现两种方法的总符合率为91.67%，符合程度高。陈小丽等[10]应用同样的两种方法检测A 型FMDV 抗体，发现总符合率为90.00%，Kappa 值为0.8，证明二者的符合率和一致性均较高。本研究结果与上述研究结果一致。

虽然应用两种方法检测猪、牛的符合率略低，但对于结果不一致的样品，其LPB-ELISA 抗体效价均在阳性判定标准的±1 滴度以内，属于正常误差范围。因LPB-ELISA 对操作要求较高，其准确性受多种因素影响，当样品抗体水平刚好处于临界值附近时，较易出现与SPC-ELISA 结果不符合的情况。之所以两种方法检测不同畜种的符合率有所差别，可能与样品质量有关。ELISA 对血清样品质量要求较高，溶血、严重混浊或被细菌污染等都可能产生非特异性显色，影响检测结果[3]。从外观上看，此次抽检的羊血清样品无溶血，质量好，两种检测方法得到的结果完全一致；而猪、牛有部分血清样品溶血严重、质量差，可能导致两种方法得到的结果有所出入，符合率相对低一点。

4 结论

应用SPC-ELISA 定性检测和LPB-ELISA 定量检测FMDV 抗体，符合率高，结果高度一致。在实际工作中，可以根据具体需要，任意选择其中一种合适的方法进行检测，但均需保证样品质量。