2022 年鄂西地区PRRSV ORF5 基因遗传进化分析

欧阳艳，刘发志，王孝忠，李祚丹，熊同舟，杜建丰

（1.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌 443000；2.宜昌市动物疫病预防控制中心，湖北宜昌 443000；3.宜昌正大畜牧有限公司，湖北宜昌 443000）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是引发猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原。目前，在全球范围内，除瑞士等少数国家没有暴发PRRS 疫情外，其他国家的养猪业都深受其害[1]。猪感染PRRSV 后表现厌食、发热、耳发绀、流鼻涕等症状，母猪感染后在怀孕110 d 左右可发生流产，产弱胎、死胎或木乃伊胎，产出的弱胎也会很快死亡[2-4]。

PRRSV 属于RNA 病毒，其结构蛋白GP5 是重要的保护性抗原蛋白，具有高度变异性，因此GP5 蛋白编码基因开放阅读框ORF5 常被用于遗传变异分析[5]。为了解鄂西地区PRRSV 的遗传变异情况，本研究对2022年采自该地区的672份猪血液、肺脏组织等样品进行实时荧光RT-PCR 检测，并对部分阳性样品进行ORF5 基因序列遗传进化分析，以期为鄂西地区PRRS 防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 PRRSV 通用型实时荧光RTPCR 检测试剂盒，购自元亨生物药业有限公司；DNA/RNA核酸提取试剂盒，购自天隆科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备 高速组织匀浆机（TissueLyser LT），德国凯杰公司产品；涡旋震荡仪（Mx-S）、赛洛捷克公司产品；高速冷冻离心机（Centriguge 5417R），德国艾本德公司产品；Ⅱ级生物安全柜（AC2-4S1），新加坡艺思高科技有限公司产品；荧光定量 PCR 扩增仪（LightCycler 96），德国罗氏诊断公司产品；生化培养箱（SPX-250B-Z），上海博讯实验有限公司医疗设备厂产品；医用冷藏箱（HYC-940），青岛海尔生物医疗股份有限公司产品；核酸提取仪（NP968），西安天隆科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集和处理 在鄂西地区采集疑似PRRS 发病猪血液、肺脏组织等样品共672 份，其中伍家岗区、夷陵区、兴山县、长阳自治县（简称长治县）、猇亭区、五峰自治县（简称五峰县）、恩施市7 个县（市、区）的血液、肺组织样品采自小规模育肥猪场，枝江市的血液、肺组织样品采自规模化种猪场。组织样品剪碎混匀后，加生理盐水充分匀浆，高速离心后，取上清液用于RNA 提取；血液样品采集后先放置在37 ℃生化培养箱中2 h，然后转移至4 ℃冰箱过夜，待血清析出后无菌分装，用于RNA 提取；抗凝血样品混匀后直接用于RNA提取。

1.2.2 引物设计与合成 使用欧阳艳等[6]设计的针对Nsp2基因的引物和1 对检测并扩增完整ORF5 基因序列的引物（表1）进行扩增。

表1 本研究使用的引物

1.2.3 RNA 提取与实时荧光RT-PCR 检测 用DNA/RNA 核酸提取试剂盒提取病毒总RNA，再使用实时荧光RT-PCR 检测试剂盒进行反转录。PCR 反应体系25.0 μL：无菌无核酸酶水5.0 μL、RT-PCR 反应液12.5 μL、酶混合液1.0 μL、荧光探针4.5 μL、模板RNA 2.5 μL。PCR 反应程序：42 ℃5 min，95 ℃变性10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40个循环，在每个循环第二步（60 ℃ 35 s）收集荧光信号。报告基团FAM，淬灭基团NONE。结束后根据样品Ct 大小及扩增曲线形成情况判定结果[7-8]。

1.2.4 ORF5 基因扩增与测序 将阳性样品用病毒核酸提取试剂盒提取RNA 后进行RT-PCR 扩增，将反应产物送擎科生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.5 ORF5 基因遗传进化分析 应用DNAstar软件对测序获取的ORF5 基因序列与参考毒株序列进行比对分析，利用Clustal 2.1 和Mega-7.0 软件，基于Neighbor-Joining 运算法，绘制遗传进化树[6]。参考毒株的背景信息见表2。

表2 参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 临床样品RT-PCR 检测

2022 年，共收集检测来自鄂西地区8 个县（市、区）的血液、肺组织等样品672 份，使用PRRSV 实时荧光 RT-PCR 试剂盒检测。结果（表3、图1）显示：33 份样品为PRRSV 阳性，阳性检出率为5%；使用欧阳艳等[6]设计的针对Nsp2基因引物进行分类，其中高致病性毒株（HP-PRRSV）23 份，占69.7%，分布于伍家岗区、夷陵区、兴山县、长阳县、猇亭区等5 个县（区），是鄂西地区主要流行毒株；类NADC30 毒株（NADC30-like PRRSV）10 份，占30.3%，分布于兴山县、长阳县、枝江市、猇亭区等4 个县（市、区），是次要流行毒株。

图1 PRRSV Nsp2 基因部分片段扩增结果

表3 2022 年病料检测结果

2.2 ORF5 基因同源性分析

本研究共扩增获得4 份阳性样品（2022YCLPFA、2022YCLPFA1、2022YCYZD、2022 YCZDBLZ）ORF5基因序列，其中2022YCLPFA、2022YCLPFA1采自长阳县，2022YCYZD采自夷陵区，2022YCZDBLZ 采 自枝江市。与参考毒株序列经同源性比对分析发现：4 份阳性样品间的ORF5 基因序列同源性为81.4%～98.5%，其与HP-PRRSV代表株JXA1同源性为80.3%～95.9%，与NADC30-like PRRSV代表株HENAN-XINX 同源性为80.8%～81.6%，与经典PRRSV 代表株VR-2332 同源性为80.3%～84.7%（图2）。

图2 ORF5 基因序列之间同源性分析结果

2.3 ORF5 序列遗传进化树分析

由图3可知：2022YCLPFA（长阳）、2022YCLPFA1（长阳）、2022YCYZD（夷陵）3份阳性样品ORF5 序列与JXA1、TJ-M 在同一分支（Lineage 8.7），属于HP-PRRSV；2022YCZDBLZ（枝江）样 品 与ZJ1407、JL580、HENAN-XINX、NADC30LIKEXD-HN-004 遗传关系较近，在同一分支（Lineage 1.9），属于类NADC30 毒株。

图3 PRRSV ORF5 基因进化树

2.4 GP5 蛋白氨基酸序列分析

经序列比对分析，GP5 蛋白氨基酸序列高变区，在诱骗表位（27～30 aa）出现29G →29C；在中和表位，HP-PRRSV 毒株出现氨基酸替换39A →39T，类NADC30 毒株出现38A →38T（图4）。

3 讨论

本研究共检测了来自鄂西地区8 个县（市、区）的672 份病料样品，发现PRRSV 阳性检出率为5%。其中：HP-PRRSV 阳性样品占69.7%，来自于伍家岗区、夷陵区、兴山县、长阳县、猇亭区等5 个县（市、区），可能是鄂西地区的主要流行毒株；类NADC30 阳性样品占30.3%，来自于兴山县、长阳县、枝江市、猇亭区等4 个县（市、区），可能是鄂西地区的次要流行毒株。从上述结果可以看出，长阳县、兴山县、猇亭区等地存在2 个毒株的混合流行，因此各场疫苗接种时要先进行检测，一定要选择与本场流行毒株匹配的疫苗，否则会导致免疫失败。

本研究获得4 份阳性样品的ORF5 基因序列同源性为81.4%～98.5%，其与HP-PRRSV代表株JXA1同源性为80.3%～95.9%，与NADC30-like PRRSV代表株HENAN-XINX同源性为80.8%～81.6%，与经典PRRSV 代表株VR-2332 同源性为80.3%～84.7%，说明鄂西地区流行毒株的ORF5 基因序列正在发生一些新的变化。

自1996 年郭宝清等[9]首次分离到PRRSV CH-1a毒株以来，Lineage8.7分支PRRSV 在我国已流行20 多年。通过遗传进化分析可知，本研究获得的2022YCLPFA、2022YCLPFA1、2022YCYZD 3 份阳性样品ORF5 序列与毒株JXA1、TJ-M在同一分支（Lineage 8.7），属于HP-PRRSV 毒 株；2022YCZDBLZ 与JL580、HENAN-XINX 遗传关系较近，在同一分支（Lineage 1.9），属于NADC30-like PRRSV 毒株。Lineage 1.9 分支PRRSV 自2013 年以来也在我国广泛流行，并不断发生变异和重组[10]。我国先后研制了经典株灭活疫苗、高致病性毒株减毒活疫苗等商品化疫苗，虽然在控制PRRS 大规模暴发方面发挥了一定作用，但PRRSV 易变异，类NADC30 毒株也开始广泛流行，因而期待更为安全有效，特别是针对类NADC30 毒株的疫苗尽早问世。

研究[11]表明，GP5 蛋白上存在的中和抗原位点与免疫保护有关。本研究获得的4 份PRRSV GP5 氨基酸序列与参考毒株比对，在诱骗表位（27～30 aa）发现氨基酸替换29G →29C，在中和表位，HP-PRRSV 毒株出现氨基酸替换39A →39T，类NADC30 毒株出现38A →38T。这些变异有可能会影响机体中和抗体的产生，但需进一步研究。

综上所述，鄂西地区存在HP-PRRSV 和NADC30-like PRRSV 两种毒株的流行，并且其GP5 蛋白氨基酸序列已发生了多个变异，有可能会影响疫苗的免疫保护效果。建议持续加强监测，一定要选择与本场流行毒株匹配的疫苗进行免疫。