半叶马尾藻岩藻聚糖硫酸酯改善环磷酰胺诱导的小鼠卵巢早衰的作用研究

史欣仪，殷浩文，胡传银，钟润芳，张诗琳，赵云涛，陈绍红

（1.广东海洋大学食品科技学院现代生物化学实验中心/广东省海洋生物制品工程实验室，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088；2.广东医科大学基础医学院，广东 湛江 524023）

卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）是指女性40 岁之前出现卵巢功能衰退、月经紊乱或闭经，并伴有雌激素分泌低下、促性腺激素水平较高等现象，甚至会导致丧失生育能力，且低水平的雌激素会增加骨质疏松、血管疾病的患病率，对女性的身心健康产生严重的影响[1]。近年来，POF 的发病呈现年轻化且逐年增长趋势，在人群中的发病率达1%～2%，其中90%的病例病因仍未明确，10%的病例与自身免疫、感染、基因和医源性等有关[2]。POF 的病因复杂，至今尚未有完全有效的治疗方案。临床上，激素替代疗法（hormone replacement therapy,HRT）是一种广泛应用改善POF 的治疗方法。HRT 有助于通过抑制负反馈调节的下丘脑-垂体-性腺轴分泌促卵泡刺激素（FSH）和促黄体生成素（LH），从而减少高水平FSH 对卵巢的破坏作用[3]。然而，长期应用HRT 会引起一系列的副作用如恶心、皮疹、子宫内膜癌、心血管疾病等[4]。

环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）是一种烷基化药物，广泛应用于癌症和自身免疫性疾病的化疗方案[5]。研究表明，注射CTX 会引起大鼠动情周期紊乱、降低雌二醇（E2）水平、促进FSH 的分泌，CTX 通过破坏卵母细胞，引起卵巢颗粒细胞凋亡，并加速卵泡衰竭和卵巢严重的血管损伤，形成卵巢间质纤维化，对卵巢造成不可逆的损害[6]。研究发现，CTX 可诱导卵巢的颗粒细胞发生过度自噬，卵泡闭锁，从而使卵巢的储备功能降低，造成POF[7]。小鼠通过注射CTX 所引起的卵巢功能衰退，卵巢组织形态学和激素水平的变化与临床医学POF 患者的病症相似，因此可通过注射一定量的CTX 来建立小鼠POF模型，用于实验研究。

半叶马尾藻（Sargassum hemiphyllum）归属褐藻门、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属，广泛分布于我国东海、南海沿岸。半叶马尾藻中岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan,SPF）含量丰富，研究表明岩藻聚糖硫酸酯具有多种不同的生物活性，包括抗凝血、抗氧化、免疫调节、抗炎、抗菌活性、抗肥胖等[8-13]。近期研究发现，海地瓜SPF 能够通过调节TLRs/MyD88 信号通路来改善CTX 造成的小鼠小肠黏膜损伤[14]。目前，SPF对POF的影响尚未有文献报道，本实验通过探索SPF对CTX诱导的POF小鼠模型是否有保护作用，为治疗POF寻找新的治疗途径与方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 半叶马尾藻SPF 制备 半叶马尾藻采摘于广东省湛江市硇洲岛低潮带岩石上，经广东海洋大学水产学院谢恩义教授鉴定确认为半叶马尾藻。半叶马尾藻经过冲洗、干燥、粉碎后通过超声波浸提工艺提取SPF，采用乙醇分级沉淀法分离纯化，再经过脱脂和脱蛋白的工艺得到初步纯化的SPF，具体制作方法参照谌素华等[15]的提取方法。

1.1.2 实验动物 27 只7～8 周龄ICR 雌性小鼠，生产许可证号SCXK（粤）2018-0002，购于广东省医学动物实验中心。将小鼠饲养在（23±2）℃相对湿度40%～70%环境下进行12 h 光照和12 h 黑暗循环。在整个实验过程中实施自由饮食和饮水。所有涉及动物的实验经广东海洋大学动物伦理委员会批准执行（批准文号：2019090502）。

1.1.3 主要试剂 CTX（C3250000）购于美国Sigma-Aldrich公司；小鼠FSH、E2酶联免疫试剂盒（H101-1-2，ML-elisa-A11412）分别购于南京建成生物科技有限公司和上海酶联生物科技有限公司；瑞氏-姬姆萨染色液（PH1793）购于福州Phygene 公司；BCA 试剂盒（23225）购于上海博彩生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒（A001-3-2,A003-1-2）购于南京建成生物科技有限公司；兔抗鼠微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC-3）抗体（NB910-40752）购于美国Novus 公司；兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体和HRP 标记抗兔二抗（2118L,7074S）购于美国Cell signaling technology公司；化学发光液（ECL）试剂盒（08-110）购于美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及POF 模型建立 小鼠适应性饲养1 周后，将27只ICR小鼠随机分为3组：空白组（Con）、模型组（CTX）、实验组（CTX+SPF）。CTX组和CTX+SPF均连续2 d腹腔注射CTX 70 mg/（kg·d）[16]，Con 组注射等量生理盐水。建模后第1天，CTX+SPF组小鼠给予200 mg/（kg·d）的SPF 灌胃治疗，Con 组和CTX 组给予生理盐水（1 mL/100 g），连续灌胃4 周，每周称质量1次。

1.2.2 动情周期观察 小鼠灌胃治疗2 周后，连续2周取阴道脱落细胞涂片观察小鼠动情周期的变化。使用加样枪吸取30 μL 生理盐水反复冲洗小鼠阴道并涂片，涂片自然干燥后，用50 μL 甲醇固定细胞，瑞氏-姬姆萨染色后，在显微镜下观察[3]。

1.2.3 卵巢和脾脏指数 小鼠连续治疗4周后，于小鼠动情间期采用小鼠颈椎脱位处死法处死小鼠，剖腹取出小鼠卵巢和脾脏。冰浴条件下，剥离卵巢和脾脏周围残留的脂肪组织后，迅速置于分析天平上精密称重记录。

1.2.4 血清中性激素浓度测定 注射10%（φ）水合氯醛麻醉小鼠，采用心脏取血法收集血液，静置1 h后，以5 000 r/min，4 ℃冷冻离心15 min，取血清并于-20 ℃冻存，ELISA 法检测小鼠血清中E2及FSH激素水平。检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 生化分析 将收集的卵巢组织置于2 mL离心管，每管加入300 μL RIPA+3 μL PMSF+3 μL PI，并放入2颗钢珠，在预冷的组织破碎机上将卵巢破碎，取出，12 000 r/min 离心10 min，取上清液。参照说明书指导，使用BCA试剂盒测定上清液中蛋白浓度后，使用SOD 试剂盒和MDA 试剂盒测定卵巢组织中SOD活性和MDA水平。

1.2.6 Western blot分析 Western blot分析参照文献[17]报道并加以适当的修改。卵巢组织预处理参考“1.2.5”，按照样品上清液体积加入1/3 体积的4×蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸5 min，冷却后置于-20 ℃冰箱中保存。卵巢组织蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并转移至聚偏二氟乙烯薄膜（PVDF）上。经过封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜后，化学发光液孵育PVDF膜，于化学发光成像仪成像。

1.2.7 数据统计与分析 应用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计学分析，数据以表示。组间比较使用单因素方差分析，所有检验均采取T多重比较法进行二次检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPF对小鼠体质量的影响

小鼠建模前各组体质量之间差异无统计学意义，注射CTX 建模后体质量都有大幅度的下降，但Con 组的下降程度比CTX 组及CTX+SPF 组低，通过灌胃治疗后，小鼠体质量均缓慢上升。连续灌胃治疗2 周后，CTX 组和Con 组体质量之间差异有统计学意义（P<0.01）；灌胃治疗3 周后，CTX 组和CTX+SPF 组体质量之间差异有统计学意义（P<0.05），提示小鼠CTX 建模成功，且SPF 具有改善CTX造成的小鼠体质量下降的作用。结果见表1。

表1 各组小鼠的体质量变化Table 1 Body weight changes of mice in each group(±s,n=9)m/g

表1 各组小鼠的体质量变化Table 1 Body weight changes of mice in each group(±s,n=9)m/g

与Con组比较：*P<0.05，**P<0.01；与CTX组比较：#P<0.05。

5周29.38±0.93 27.16±1.34**28.83±1.71#组别Con CTX CTX+SPF 0 27.11±1.13 26.8±1.61 27.3±1.32 1周24.18±0.97 23.02±1.10 23.65±1.36 2周28.67±1.30 26.66±1.60**27.86±1.06 3周28.77±1.15 26.99±1.82*28.83±1.69#4周29.08±0.98 27.11±1.30**28.86±1.28#

2.2 SPF对小鼠动情周期的影响

小鼠一个完整的动情周期包括4个部分：动情间期、动情前期、动情期、动情后期。各期间对应的小鼠阴道脱落细胞的形态不同。动情间期：小鼠卵巢上黄体开始功能性退化，阴道涂片的细胞中几乎全是白细胞；动情前期：小鼠卵泡开始发育，阴道涂片中多数为椭圆形的有核上皮细胞，少数白细胞和角质化上皮细胞；动情期：小鼠卵泡发育成熟，阴道涂片中几乎全是无核的角化鳞片状细胞，细胞呈大而扁平的形状，边缘不整齐；动情后期：小鼠卵巢中生成黄体，阴道涂片中细胞形态混杂，同时含有有核上皮细胞、无核鳞片状上皮细胞和白细胞[18]。见图1。

图1 小鼠动情周期各阶段脱落细胞示意图（瑞氏-姬姆萨染色，标尺：100 μm）Figure 1 Cast-off cells at each stage of estrous cycle in mice（Wrignt's-Giemsa Stain，bar：100 μm）

本实验中，以动情周期在4～5 d 且各周期分布均匀为正常周期，周期<4 d 或>5 d 且周期紊乱为不正常周期。Con 组小鼠均维持正常的动情周期，CTX 组中有77.78%的小鼠动情周期紊乱，CTX+SPF 组动情周期紊乱的占22.22%，提示SPF 能够有效改善CTX造成的动情周期紊乱。见图2。

图2 各组小鼠动情周期的变化Figure 2 Changes of estrous cycle of mice in each group（n=9）

2.3 SPF对小鼠卵巢指数和脾脏指数的影响

CTX组小鼠与Con组小鼠的卵巢指数差异有统计学意义（P<0.01），表明CTX可以降低小鼠的卵巢指数，对小鼠的卵巢造成一定的损伤。CTX+SPF组小鼠的卵巢指数与CTX 组比较差异有统计学意义（P<0.05），表明SPF 能够有效改善CTX 诱导的小鼠卵巢损伤。CTX组小鼠的脾脏指数与Con组小鼠比较、CTX+SPF 组小鼠的脾脏指数与CTX 组小鼠比较差异均有统计学意义（P<0.05），表明CTX会对小鼠的脾脏造成损伤，降低机体的免疫能力，而SPF治疗后能够有效增加小鼠的脾脏指数，减少CTX 对脾脏造成的损伤，提高小鼠的免疫能力。见图3。

图3 SPF对小鼠脏器指数的影响Figure 3 Effect of SPF on organ index in mice(±s,n=9)

2.4 SPF对小鼠性激素分泌的影响

实验结果表明，小鼠注射CTX 会显著升高血清中FSH、减少E2的分泌（P<0.01），对小鼠的激素分泌水平造成影响，说明CTX 会对下丘脑-垂体-性腺轴产生干扰，影响小鼠的正常生长发育。与CTX 组相比，SPF能够有效地减少FSH的分泌和增加E2的分泌（P<0.05），缓解CTX对小鼠造成的损伤。见图4。

图4 各组小鼠的激素水平变化Figure 4 Hormone level changes of mice in each group(±s,n=3)

2.5 SPF对小鼠卵巢SOD和MDA的影响

与Con组比较，CTX 组小鼠卵巢的SOD 活性显着降低（P<0.01），MDA 含量显着增加（P<0.01），这表明CTX 破坏了小鼠卵巢中氧化还原反应的平衡。经过SPF 灌胃治疗后，CTX+SPF 小鼠卵巢的SOD活性显着上升（P<0.05），MDA 含量显着下降（P<0.05）。见图5。

图5 SPF对小鼠卵巢SOD和MDA的影响Figure 5 Effect of SPF on SOD and MDA in ovary of mice(±s,n=3)

2.6 SPF对卵巢LC3蛋白的影响

细胞的自噬水平以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ为指标，比值增大时，其自噬水平提高，比值减少时，其自噬水平降低。CTX组小鼠卵巢中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大（P<0.05），且LC3 蛋白的含量升高；CTX+SPF 组小鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值减小（P<0.05），且LC3蛋白的含量减少，其自噬水平明显降低，说明SPF能够有效抑制细胞的自噬，维持机体平衡。见图6。

图6 SPF对卵巢LC3蛋白的影响Figure 6 Effect of SPF on ovarian LC3 protein(±s,n=4)

3 讨论

POF 不仅会对卵巢的功能造成影响，还会影响机体的内分泌平衡，导致其他器官和系统也造成一定的损伤[19]，营养疗法（nutritherapy）是预防和干预POF 的重要途径之一。研究表明，半叶马尾藻中SPF 含量丰富，且SPF 具有多种不同的生物活性，包括抗凝血、抗氧化、免疫调节、抗炎、抗菌活性、抗肥胖等。本实验研究了半叶马尾藻SPF 在CTX 诱导的小鼠POF的作用及相关机制。

结果显示，腹腔注射CTX后，小鼠的体质量第2周开始出现大幅度下降，灌胃SPF 后能够明显改善POF小鼠的体质量下降。卵巢指数能够反映小鼠的卵巢功能，且小鼠的动情周期也是受卵巢功能调控的一项生理反应，当卵巢功能受到破坏时，其卵巢质量会有所降低且动情周期也会发生紊乱。表明SPF能够增加由CTX 造成的卵巢质量下降，并且能有效改善动情周期的规律性。另一方面，SPF 还能通过改善小鼠脾脏指数，增强小鼠自身的免疫能力[20]。

卵巢内分泌水平是反映卵巢功能的间接指标，通过下丘脑-垂体-性腺轴调控着其各种激素的分泌水平，即下丘脑通过分泌促性腺激素释放激素（GnRH）作用于垂体，并促使垂体分泌FSH 等激素，正反馈作用于卵巢，从而使卵巢分泌E2，当E2分泌的含量过高时，通过负反馈抑制GnRH和FSH，从而维持正常的激素水平[3，21]。正常女性体内的激素水平是在一定范围内上下波动，维持一个动态平衡的状态。动情周期也是受到激素水平的调节，从而出现有规律的周期变化。FSH 的作用主要是促进卵泡颗粒细胞分化成熟，控制卵泡的发育，当FSH 的含量偏高时，其促进卵泡的过早成熟及提早排放，造成卵泡的衰竭[22]。E2是卵巢内成熟卵泡分泌的一种雌激素，其作用是促进卵巢颗粒细胞增殖分化，调控颗粒细胞的凋亡，调节类固醇激素水平等，当E2分泌水平过低时，会对机体的性功能及女性第二特征等造成影响。FSH和E2被视为评价卵巢功能的重要指标，当FSH 的分泌水平过高且E2的分泌水平过低时，可初步判断出其卵巢的储备功能，对判断卵巢早衰有重要的作用[23]。本实验研究发现，SPF 能够显著改善由CTX 造成的FSH 升高、E2降低的现象，表明SPF 可直接或间接作用于下丘脑-垂体-卵巢性腺轴，从而调节内分泌水平，缓解POF的影响。

越来越多的证据表明，氧化应激在POF 的发生中有一定的作用。SOD 是一种存在于生物体中的抗氧化金属酶，在机体内氧化反应平衡中起到重要作用。而MDA 是氧自由基诱导的脂质过氧化的产物，MDA 水平的变化反映了氧化应激作用[24-25]。本研究发现，CTX 组小鼠卵巢中SOD 活性显著下降（P<0.01），MDA水平显著上升（P<0.01），这与Zhao等[3]报道的一致。提示SPF 具有抗氧化功能，因此推测半叶马尾藻SPF 可能改善CTX 诱导的小鼠卵巢氧化应激作用。

自噬是维持机体内平衡的一种方式，通过降解衰老或损伤的细胞或器官，使机体能够正常运行[26]。研究表明，当自噬机制启动时，机体内的LC3-Ⅰ会向LC3-Ⅱ转化，因此机体自噬水平的大小可通过LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小来衡量，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大时，机体的自噬水平提高，相反LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值减小时，机体的自噬水平降低。自噬对机体的正常运行起一定的作用，但当自噬水平过高时，机体的正常细胞或器官受到溶解，破坏机体的内平衡[27]。当组织中的自噬水平增高，其可能是由于卵巢颗粒细胞或卵母细胞的过度自噬，造成卵泡衰竭，从而导致卵巢早衰[28]。本研究表明，CTX 处理后的小鼠卵巢组织中的自噬水平增高，而经过SPF 治疗后的小鼠，能够显著降低小鼠的自噬能力，并维持在正常的水平。因此，SPF可能通过恢复小鼠的自噬水平，保护卵泡细胞，从而预防POF。

综上所述，半叶马尾藻SPF 可以改善由CTX 诱导的小鼠POF，其改善机制可能是与通过改善性周期紊乱、调节雌激素分泌、改善卵巢氧化应激状态、调节自噬水平有关。结果提示半叶马尾藻SPF可以作为基础原料开发日常保健品，延缓POF 的发生，具有一定的开发潜力。