环状RNA在糖尿病肾病中的研究进展

姜赫，刘武，吕纯懿，张诏△

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是常见的糖尿病并发症之一，也是导致终末期肾病的主要原因［1］。DKD病理机制复杂，涉及代谢紊乱、线粒体氧化应激与血流动力学紊乱等［2］。现有治疗在一定程度上只能减缓而不能阻止或逆转DKD 的进展［3-4］。因此，进一步研究影响DKD 进展的病理机制，以鉴定新的分子标志物及开发新的治疗策略至关重要。随着分子生物学及测序技术的发展，越来越多的环状RNA（circular RNA，CircRNA）被发现，其功能也被广泛研究。CircRNA反向剪接的共价闭环结构，对外源核酸酶具有天然的抗性，与线性结构相比更稳定，也为CircRNA 作为生物标志物和调控因子奠定了基础。近年来，大量研究表明CircRNA与某些肾脏疾病的发病机制有关［5-6］。本文旨在归纳与总结CircRNA 在DKD 肾脏细胞损伤中的作用，以期为前临床提供新的思路。

1 CircRNA的结构与功能

1.1 CircRNA 的合成及生物学特征 CircRNA 是由前 体 信 使RNA（precursor messenger RNA，premRNA）后向剪接，通过5'-帽结构和3'-聚A 尾的共价键结合形成的闭环结构。CircRNA通过内含子配对驱动、RNA 结合蛋白驱动和套索驱动实现其环化机制的形成［7］。根据其序列，可将CircRNA 分为4类：外显子CircRNA（EcircRNA）、环内含子RNA（CiRNA）、外显子-内含子RNA（EIciRNA）和tRNA内含子CircRNA（TricRNA）［8］。CircRNA在不同组织与条件下表达模式不同，其在大脑和肾脏中含量丰富，在病理状态下会异常表达，并且可在血液、尿液、唾液以及外泌体中检测到［9-10］，因而具有作为生物标志物的潜力。

1.2 CircRNA功能

1.2.1 CircRNA作为miRNA的海绵 目前研究最广泛的CircRNA 的生物学功能是作为miRNA 的海绵，即CircRNA 与miRNA 反 应元件（miRNA response elements，MRE）结合，通过隔离miRNA 发挥竞争性结合RNA（competing endogenous RNA，CeRNA）的作用［11］，从而调节下游mRNA的表达。

1.2.2 与RNA 结 合 蛋 白（RNA-binding proteins，RBPs）结合 CircRNA 可与多个RBPs 相互作用，从而影响它们的作用模式，调节生物功能。RBP 基因也可以转录成许多含有相应RBP 结合位点的CircRNA，如RNA 聚合酶Ⅱ（RNA Polymerase Ⅱ，PolⅡ）可以与CircRNA 结合，影响CircRNA 的剪接、折叠、稳定、加工和定位［12］。RBPs quking-5（QKI-5）通过与CircRNA 相互作用，促进上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过 程 中CircRNA的生物发生［5］。

1.2.3 参与转录调控与翻译 定位于细胞核的CircRNA 通过与PolⅡ或剪接因子U1 SnRNP（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 SnRNP）相互作用，激活其亲本基因的转录［13-14］。作为非编码RNA，CircRNA 能否被翻译尚存有争议。传统观点认为，由于缺失5'7-甲基鸟苷（M7G）帽和3'聚A 尾，CircRNA 是不能被翻译的。然而最近研究表明，一些CircRNA，如CircMb1、CircFBXW7、CircPINTexon2和Circ-SHPRH 等可以被翻译成蛋白质或多肽［15］。但这些CircRNA 翻译的详细机制及大多数CircRNA衍生肽的功能仍然未知。

2 CircRNA在DKD肾脏细胞中的作用

DKD 的特征性临床表现是持续、缓慢发展的蛋白尿，其损害可能累及肾脏所有组织，最终导致小动脉壁的透明改变［16-17］。早期可出现系膜细胞异常增殖、基底膜增厚、系膜基质增宽、肾小球硬化和足细胞丢失。尽管肾小管基底膜增厚，但晚期可出现肾小管萎缩、细胞凋亡增加、间质性炎性浸润、间质纤维化和管周毛细血管稀疏［18］。DKD 的病理过程涉及多种分子途径，越来越多的证据表明CircRNA 异常表达在DKD 中发挥作用［6］。有研究表明，肾小管间质细胞、肾小球系膜细胞、足细胞功能障碍与DKD进展密切相关［19］。本文从肾脏细胞的角度，归纳与总结DKD中CircRNA的作用。

2.1 在肾小球系膜细胞损伤中的作用 肾小球系膜细胞（mesanial cells，MCs）是肾小球的重要构成成分，在生理功能和肾脏疾病的发生发展中发挥重要作用。MCs能够保持肾小球毛细血管的结构类似于微血管周细胞的功能。同时，MCs 有助于系膜基质的动态平衡，调节滤过表面积，吞噬凋亡细胞。系膜细胞肥大、增殖和纤维化已被认为是细胞损伤的常见生物学反应。由于肾小球系膜细胞异常发育与DKD的病理变化密切相关［20］，肾小球MCs被广泛应用于体外DKD研究。

目前，有关CircRNA 在MCs 中的研究主要集中在细胞异常增殖、细胞外基质积聚以及纤维化方面。纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ型胶原（collagenⅠ，COLⅠ）、COLⅣ等纤维蛋白增加是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）堆积和系膜细胞增殖以及纤维化的病理基础［21-23］。Liu 等［24］研究发现，CircHIPK3 在DKD 患者以及高糖诱导的MCs 中上调，沉默CircHIPK3 后，转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）、COLⅠ、COLⅣ、FN 的mRNA 表达水平降低，细胞周期蛋白D1、增殖细胞核抗原的mRNA 丰度明显下降，沉默miR-185 可逆转这一效果。 这些结果表明CircHIPK3 通过调节MCs 细胞周期与纤维蛋白沉积调控DKD 进展。Bai 等［25］发现高糖培养的MCs、DKD 患者和DKD 大 鼠模型中Circ_DLGAP4 表达增加，exo-Circ_DLGAP4_通过吸附miR-143 来调节受体酪氨酸蛋白激酶/核因子-κB/基质金属蛋白酶2（ERBB3/NF-κB/MMP2）轴，进而促进系膜细胞增殖和纤维化，导致肾小球滤过屏障受损；进一步体内实验表明，Circ_DLGAP4 过表达后通过调节miR143/ERBB3/NF-κB/MMP2 通路促进DKD 的进展。Liu等［26］研究发现，Circ_0080425（Circ_WBSCR17）与miR-24-3p的竞争性结合释放了抑制miR-24-3p的成纤维生长因子11（fibroblast growth factor11，FGF11），从而导致DKD进展过程中细胞增殖和纤维化水平升高。Wang 等［27］研究发现，Circ_LARP4 在DKD细胞模型中下调，随后将Circ_LARP4质粒转染系膜细胞后，发现过表达的Circ_LARP4抑制系膜细胞增殖并增加凋亡率，降低系膜细胞纤维化相关蛋白表达，该过程通过竞争性结合miR-424 实现。因此，可以将Circ_LARP4/miR-424细胞信号轴作为体外调控DKD发生发展的候选靶点。

此外，CircRNA 参与氧化应激与炎症反应调控系膜细胞损伤。Chen等［28］研究发现，CircLRP6通过与miR-205 竞争性调节高迁移率蛋白B1（high mobility group protein-B1，HMGB1），激活下游TLR4/NF-κB 通路，从而升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，降低超氧化物歧化酶（serum superoxide dismutase，SOD）活性，并增加基质蛋白FN、COLⅠ、COLⅣ与炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表达，提示CircLRP6 通过调节MCs 细胞增殖、氧化应激、细胞外基质积聚与炎症反应参与DKD 中MCs 损伤。活性氧的过量产生是DKD 代谢紊乱与肾脏血流动力学紊乱的共同特征［29］，过量活性氧会引发肾脏纤维化与炎症，并通过促脂质氧化、DNA 损伤、蛋白修饰及线粒体功能障碍，导致组织损伤。

2.2 在肾小管上皮细胞损伤中的作用 DKD 的进展伴随着肾小管损害，肾小管上皮细胞损伤参与了DKD 的发生，并且在DKD 患者和DKD 动物模型中均发现肾小管上皮细胞的炎症反应和细胞凋亡。Li等［30］研究发现，Circ_WBSCR17 在DKD 小鼠模型和HK-2 细胞模型中的表达显著上调，Circ_WBSCR17通过竞争性结合miR-185-5p 激活转录因子SOX6，SOX6的过表达促进细胞炎性因子的释放，抑制细胞活力，诱导细胞凋亡，促进肾间质纤维化。Wen等［31］研究发现CircACTR2 在高糖诱导的HK-2 细胞中上调，抑制CircACTR2 显著减少嗜酸细胞，并抑制IL-1β、COLⅠ、COLⅣ、FN 等向培养基中的释放，提示在高糖环境下，CircACTR2 可调节高糖诱导的近端肾小管细胞焦亡、炎症和纤维化。Zhuang 等［32］研究表明，CircHIPK3 在高糖诱导的HK-2 细胞中下调，将CircHIPK3高表达质粒转染HK-2细胞，结果发现CircHIPK3 过表达上调Bcl-2 的表达，而下调了caspase3 和Bax 的表达。其证实了CircHIPK3 过表达通过促进HK-2细胞增殖和抑制细胞凋亡来减轻高糖诱导的细胞损伤。

2.3 在足细胞损伤中的作用 足细胞是终末分化的上皮细胞，损伤后不易增殖和再生，作为肾小球滤过膜的组成部分，足细胞结构完整与数量稳定是维持肾小球滤过率的基础。足细胞损伤是DKD 细胞损伤中的关键环节［33］，CircRNA 作为miRNA 的海绵与miRNA通过抗氧化、抗炎等途径共同调节DKD足细胞凋亡和损伤。Yao等［34］研究发现，Circ_0000285在DKD 足细胞中表达上调，将CIRC_0000285 过表达质粒转染小鼠足细胞，发现足细胞周期被阻滞在G1 期，细胞增殖受到抑制，凋亡增加，并且Circ_0000285 充当miR-654-3p 的海绵激活丝裂原活化蛋 白 激 酶6（mitogen-activated protein kinase 6，MAPK6），调节炎性因子释放，导致足细胞损伤。

另外，高糖环境促进快速氧化应激，是足细胞减少的主要原因［35］。活性氧的过量产生与抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的还原共同导致细胞线粒体损伤［36］。而GPX4作为调节维持组织内环境平衡的关键酶，其表达降低会导致膜脂过氧化产物积聚［37］，从而导致铁依赖性非凋亡性细胞死亡，即铁死亡［38］。有研究表明，CircRNA 以铁依赖的方式发挥作用［39］。Jin 等［40］研究发现MMU_CircRNA_0000309在DKD小鼠足细胞中下调，并通过激活miR-188-3p/GPX4 途径调节线粒体损伤以及铁死亡，从而导致足细胞损伤。但由于目前CircRNA 在DKD 足细胞中的研究较少，证据尚不充分，因此继续明确CircRNA 在足细胞损伤中的分子机制，仍是后续待探讨的问题。

3 CircRNA在DKD中的研究前景

氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、纤维化等肾脏细胞损伤被认为是DKD 发病的相关因素［2］，因此探索抑制细胞损伤的有效药物可以协助治疗。目前，CircRNA已被证实是前列腺癌、非小细胞肺癌、阿尔茨海默病以及急性心肌梗死等疾病的候选生物标志物［41-43］，而且在DKD 动物模型中也展现出基因治疗的潜力。Peng 等［44］利用超声-微泡介导的Circ_010383表达质粒导入DKD模型小鼠肾脏中，发现可以延缓肾小球硬化与肾小管间质纤维化，恢复肾功能。

虽然许多CircRNA 已经在肾脏组织中被证实，但其在DKD 发展过程中的表达谱和潜在作用，如何对其调控，与特定蛋白以及其他非编码RNA的相互作用机制尚不清楚。因此，进一步深入了解CircRNA在DKD发病机制中的分子功能有助于更好地理解肾脏的病理生理。研究这些分子在细胞和动物模型中的潜在功能，进一步探讨CircRNA 在肾脏疾病中的预测作用，仍是后续研究应努力的方向。

4 小结

肾小球细胞与肾小管细胞具有不同的病理生理功能，但其相互作用，共同调控DKD 的进展。CircRNA可能是DKD发病机制中的关键调节因子以及治疗的有效途径。目前的证据主要来自肾小球系膜细胞与肾小管上皮细胞，CircRNA 在其他肾脏细胞中的功能有待进一步研究。随着基因芯片和高通量测序等技术的发展与应用，CircRNA 在DKD 中发挥的作用会逐步被阐明，有助于进一步深入了解CircRNA 在DKD 发病机制中的分子功能，更好地理解肾脏的病理生理机制，并研究这些分子在细胞和动物模型中的潜在治疗能力，为以后科研成果转化奠定基础。