孙瑞红,杨 璐,陶子琦,张世昌,谢梦晓,谢而付,穆 原,蒋 叶
(1.南京医科大学第一附属医院检验学部,南京 210029;2.国家医学检验临床医学研究中心分中心,南京 210029)
总胆固醇(total cholesterol, TC)是血液中所有脂蛋白所含胆固醇的总和,包括游离胆固醇和胆固醇酯。TC水平升高容易引起动脉粥样硬化性心、脑血管疾病,如冠心病、心肌梗死、脑卒中等;降低则常见于甲状腺功能亢进[1]、严重的肝脏疾病、营养不良等。因此,TC水平的准确测定对多种疾病的诊治具有重要的临床意义。目前,酶法是临床检测TC最常用的方法之一。以往的研究发现,高胆红素水平对TC的检测可产生负干扰,但在不同的检测系统中研究结果存在差异[2-6]。有研究探讨了罗氏检测系统中高胆红素对TC检测的干扰,并提出当TC>4mmol/L可利用公式校正法消除干扰[2];在贝克曼检测系统中尚未见相关研究报道。本研究通过人工制备黄疸标本,观察在贝克曼库尔特 AU5800生化分析系统中对TC检测结果的影响,并探讨利用公式校正法来纠正此影响,以期提高黄疸患者TC检测的准确度。
1.1 研究对象 收集100例来自于南京医科大学第一附属医院2020年12月门诊或住院患者的新鲜血清标本,标本无黄疸(TB<10 μmol/L)、无溶血、无脂血,所有标本的TC水平区间为1.17~16.25 mmol/L。其中50份标本用于研究黄疸对TC测定的干扰,并建立一个个性化公式来纠正此干扰;另外50份标本用于验证该校正公式的性能。本研究经我院伦理委员会审核通过,所有研究对象均签署知情同意书。
1.2 仪器与试剂 贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)。总胆固醇测定试剂盒(酶法,批号:AUZ 7600)及生化多项校准品(货号:66300,批号:1121)[贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司];总胆红素测定试剂盒(钒酸盐氧化法,批号:20200612)及胆红素校准品(批号:20200814)(上海科华生物工程股份有限公司);胆红素溶液制备用胆红素标准品(批号:H31O9Z73747)(上海源叶生物科技有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 胆红素溶液制备:胆红素标准品20 mg,加入0.1mol/L NaOH溶液 5.70 ml,混匀,制成计算浓度为6 000 μmol/L的胆红素溶液,-20℃冷冻,待用。实验前用生理盐水将此溶液配成胆红素浓度为 1 000,2 000,3 000,4 000 和 5 000 μmol/L 的溶液。
1.3.2 人工黄疸标本制备:分别取20 μl上述溶液与对应患者血清180 μl混合,制备成胆红素浓度为 100,200,300,400,500和 600 μmol/L的血清标本(标记为实验组1~6),因称量误差及胆红素降解等原因,TB浓度在实验前以仪器实测值为准;将20 μl 生理盐水加入180 μl血清中,作为对应患者的无黄疸血清。
1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 8.3.0软件进行数据处理。计量数据经Kolmogorov-Smirnov 检验,符合正态分布,以均数±标准差(±s)表示;两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差检验;不同指标相关性采用Pearson相关性分析;校正公式通过多元回归分析,拟合计算回归曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 TC检测结果受不同浓度胆红素的影响 将50例患者血清分别用胆红素溶液配置成不同胆红素水平(实验组1~6)的人工黄疸标本,以生理盐水配制的血清标本作为对照组,分别检测标本中的TC和TB浓度。同一患者标本随着TB浓度增加,其TC检测结果呈逐渐下降趋势。黄疸实验组与生理盐水对照组进行多组间比较,组间差异具有统计学意义(F=3.947,P<0.01)。以TB浓度为X,实测TC浓度为Y,对不同患者标本的变量X,Y分别进行回归分析,均r2>0.920,见图1。将所有患者标本的变量X,Y进行回归分析,TC浓度与标本TB浓度呈密切负相关(r²=0.989 4)。
图1 TC检测结果受不同浓度胆红素的影响
2.2 TC检测结果受不同浓度胆红素干扰产生的偏倚分析 见表1。将对照组标本TC浓度作为初始值,计算加入不同浓度胆红素溶液后TC浓度的偏倚,并分析不同实验组的平均偏倚,发现在实验2~6组,即加入胆红素浓度为200~600 μmol/L时,TC的平均偏倚绝对值均超过了10%,且随着TB浓度增加而递增。根据初始TC浓度,将样本分为TC≥3 mmol/L和TC<3 mmol/L两组,并采用独立样本t检验对两组进行分析比较,发现相同组别的实验组中,初始浓度TC<3 mmol/L的标本产生的平均偏倚均明显高于TC≥3 mmol/L的标本,差异具有统计学意义(均P< 0.01);且在实验1组,即加入胆红素浓度为100 μmol/L时,前者的平均偏倚为-4.66%,而后者高达-14.05%。
表1 TC检测结果受不同浓度胆红素干扰产生的平均偏倚[(±s)%]
表1 TC检测结果受不同浓度胆红素干扰产生的平均偏倚[(±s)%]
组别 总平均偏倚平均偏倚t值 P值初始TC≥3mmol/L 初始TC <3mmol/L 1-6.65±4.89 -4.66±2.92 -14.05±3.34 9.192 <0.001 2-14.21±8.89 -10.35±4.51 -28.61±5.67 11.280 <0.001 3-29.00±13.43 -15.32±6.89 -43.54±6.31 12.265 <0.001 4-31.07±14.62 -24.77±8.57 -54.57±5.14 10.966 <0.001 5-38.21±13.95 -32.33±8.76 -60.09±4.24 14.836 <0.001 6-43.51±12.69 -38.66±9.48 -61.56±2.73 13.518 <0.001
2.3 回归校正公式的建立 设无黄疸血清标本的TC浓度为Y,其对应人工黄疸标本的TB实测值为X,TC实测浓度为Z,对来自50例患者的350份标本进行多元回归分析,计算得到多元回归公式Y= 0.002 353·X+ 0.973·Z+ 0.000 337·X·Z-0.013 34,r2值为 0.991 3。
2.4 回归校正公式的验证 为评价校正公式的纠偏效果,另取50例患者的血清标本,配置成6个不同浓度的人工黄疸标本,将测定的TC和TB浓度代入校正公式,计算得到校正后TC浓度,与对应的无黄疸血清所测得的初始TC浓度进行线性回归分析,两者高度相等,r2值为0.990 4,见图2。按照美国CLIA’88能力比对检验的分析质量要求,TC测定的可接受范围为10%,以此作为校正值可接受的检验标准。300份人工黄疸标本TC浓度的平均偏倚为-25.78%,经公式校正后,平均偏倚为1.70%;偏倚在±10%以内的可接受标本的数量由校正前的23.33%增加至校正后的92.67%,见图3。其中初始TC<3mmol/L的标本,可接受标本的数量由校正前的3.03%增加至校正后的74.24%,初始TC≥3 mmol/L的标本,可接受标本的数量由校正前的29.06%增至97.86%。
图2 经公式校正后TC浓度与无黄疸标本中初始TC浓度的回归
图3 TC检测结果校正前后的变化
临床工作中常出现TC检测结果小于高密度脂蛋白胆固醇(high density liptein cholesterol,HDL-C)与低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)之和的情况,在排除试剂及吸样等问题后,观察到此现象常伴随着胆红素水平的异常增高。高浓度胆红素对胆固醇存在负干扰早有报道,但以往的报道中研究结果并不一致。NICOLAY等[2]研究发现黄疸对TC和HDL-C有负干扰;另有研究发现黄疸对HDL-C检测无干扰[4-5],对TC和LDL-C检测则有负干扰[4];也有研究指出黄疸对HDL-C有负干扰,对TC未发现明显干扰[6]。这些不同的发现可能与各研究中TC,HDL-C和LDL-C的检测试剂、检测方法以及仪器型号的不同有关。本实验室采用贝克曼库尔特AU5800生化分析仪及配套试剂进行胆固醇的检测,依据试剂说明书:胆红素浓度137 μmol/L以内对TC干扰小于10%,而684 μmol/L以内的胆红素对HDL-C和LDL-C产生的干扰小于3%。本研究前期利用小样本预实验验证了加入600 μmol/L以内胆红素溶液对HDL-C和LDL-C检测无明显干扰,但对TC存在明显负干扰,与试剂说明书一致。故推测临床工作中出现的TC小于HDL-C与LDL-C之和的现象主要源于高浓度胆红素对TC造成的负干扰。
本研究通过人工制备黄疸标本,观察了在贝克曼库尔特 AU5800生化分析系统中酶法检测TC受黄疸干扰的程度。研究发现,随着标本TB浓度增加,TC浓度的负偏倚增大;当干扰物胆红素浓度相同时,初始TC浓度低于3mmol/L的标本受干扰后产生的偏倚远高于初始TC浓度高于3mmol/L的标本。由此可见,高浓度胆红素对TC的干扰程度不仅与标本的胆红素浓度相关,也与其初始TC浓度有关。同时,研究中也观察到当标本的TC浓度较低(<3 mmol/L)时,100 μmol/L左右的胆红素对TC的干扰值大于10%,这与其试剂说明书中关于黄疸干扰的说明并不完全一致,因此评价黄疸的干扰时还需考虑标本的TC浓度。
黄疸是临床生化检验中最常见的干扰因素之一,其干扰机理主要有两种[7-8]:①吸光度干扰:胆红素在水溶液中不稳定,易氧化为胆绿素和胆褐素,胆红素其本身的吸光度及转化过程中吸光度的变化会干扰生化项目检测的准确度;②化学反应干扰:胆红素本身是一种还原剂,可以中和试剂中具有氧化性的成分或中间反应产物,在Trinder反应中,可中和中间产物H2O2,使产物减少而导致结果偏低;本实验室中TC,HDL-C和LDL-C等项目最后显色反应均为 Trinder 反应,但TC检测采用单试剂,而HDL-C和LDL-C检测均采用双试剂,因此抗胆红素干扰的能力强于TC检测。目前对于消除黄疸干扰的研究主要集中于两种方式:一是添加化学试剂氧化胆红素,常用的氧化剂有胆红素氧化酶[9]以及亚铁氰化物[10]等,但仅可校正部分干扰,且这些化学物对其它生化项目的影响并不明确,因此临床应用的可行性较差;二是数学校正公式,该方法简便易行且无成本,易应用于临床。
本研究明确了贝克曼检测系统中TB对常规酶法检测TC结果的负干扰作用,进一步建立了一个有效的校正公式,经公式校正后92.67%的黄疸标本TC浓度偏倚小于±10%,尤其对于初始TC浓度大于3mmol/L的标本,经公式校正后97.86%的标本偏倚小于±10%,而TC浓度小于3mmol/L的标本,经公式校正后偏倚小于±10%的标本比例略低,为74.24%,这可能与研究中低浓度的TC标本量较少有关。
因此,当实验室采用单试剂酶法检测TC时,检验人员需关注患者的胆红素水平,对黄疸标本的TC结果受到负干扰,以至低于HDL-C与LDL-C之和的现象作出合理解释,协助临床医生的诊疗。另外,可进一步扩大样本量对校正公式进行校正和验证,以期能应用于临床,提高黄疸患者TC检测的准确度,为黄疸患者并发血脂异常相关疾病的诊治提供更可靠的依据。