应用UPLC-MS/MS检测上海市成年健康人群血清维生素B6和B7参考区间的建立

李爽爽，王志成

（1.苏州高新区人民医院检验科，江苏苏州 215129；2.复旦大学附属华山医院检验科，上海 200040）

维生素B6和B7是水溶性B族维生素成员之一，是人体不可缺少的营养元素。维生素B6不仅与糖尿病[1]、炎症[2]、癌症[1,3]和新冠肺炎病[4]的预后密切相关，同时还是一种有效的抗氧化剂[5]。维生素B7在维持大脑功能和神经系统方面至关重要[6]，同时还可以改善脱发和脂溢性皮炎[7]。超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLCMS/MS）是检测维生素水平的最新技术，具有高准确性和重现性，且操作简单[8]。准确可靠的参考区间对于检验项目结果的解释以及临床决策至关重要，然而多数医院使用试剂说明书提供的参考区间，忽略了不同地区、年龄、性别和检测方法等差异的影响。目前关于维生素B6和B7参考区间的调查和建立研究尚少，本研究根据美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）和国际临床化学联合会（International Federation of Clinical Chemistry, IFCC）共同发布的EP28-A3c指南[9]，采用UPLC-MS/MS方法建立上海地区成年人血清维生素B6和B7的参考区间，以期为本地区的维生素B6和B7的合理应用提供判断标准。

1 材料和方法

1.1 研究对象 选取2021年9月～2022年2月在复旦大学附属华山医院检验科进行健康体检的成年人1 059例，其中男性580例，女性479例。纳入标准：身体健康，饮食正常，1个月内未服用维生素B6和B7补充剂，未接受手术或药物治疗，无急、慢性病史。参照世界卫生组织（WHO）年龄划分标准，将1 059例成年人分为三组：18～44岁为青年组，45～59岁为中年组，≥60岁为老年组。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器：超高效液相色谱质谱联用仪（Waters公司，型号：ACQUITY I-S），医用高速冷冻离心机（eppendorf 公司，型号：5804R），涡旋混合仪（Kylin-Bell 公司，型号：Vortex-5）和可调移液枪（Thermo Scientific 公司）等。

1.2.2 试剂：标准品、标准品稀释液、质控品、内标、复溶液、提取液、流动相A及流动相B均购自英盛生物技术有限公司，实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温40℃，进样量5 μl，用流动相A和B进行梯度洗脱，见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.2 质谱条件：电喷雾离子源 ( electrospray ionization，ESI )，多反应监测模式 ( multiple reaction monitor，MRM)；采集离子对：维生素B6质荷比为184.1→148.0，维生素B7质荷比为 245.1→227.0。

1.3.3 标准品准备与处理：分别取适量标准品，用标准品稀释液定容，然后用蒸馏水配制一定浓度的混合标准品，稀释后维生素B6浓度为0.781，1.563，3.125，6.25，12.5，25.0 和 50.0 ng/ml，维生素B7浓度为0.156，0.313，0.625，1.25，2.5，5.0和 10.0 ng/ml。准确移取 60 μl各浓度标准品于EP 管中，加入60 μl维生素B6和B7混合内标液，在涡旋仪上充分涡旋5 min，然后在高速离心机中12 000 r/min离心10 min，取上清液70 μl至96孔板中，正压过滤1 min，静置5 min，加入750 μl提取液，正压收集1 min，再次加入750 μl提取液，正压收集1 min，氮吹20 min，加入 100 μl复溶液震荡2 min后移至进样板。

1.3.4 血清样本的处理：采集健康体检者空腹静脉血3 ml，置于分离胶促凝管中，4 000 r/min离心10 min，收集血清于-80℃保存，溶血、脂血样本需重新采集，样本的前处理严格按照实验室标准操作规程执行，后续操作步骤同标准品。

1.3.5 数据分析：通过7个浓度的标准品计算标准曲线，然后将样品中维生素B6和B7峰面积与相应的内标峰面积的比值带入标准曲线，计算出样品中维生素B6和B7浓度。每批次实验室检测的室内质控均在控，每年参加国家卫生健康委临床检验中心室间质评成绩均合格。

1.4 统计学分析 实验数据采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。采用箱式图法剔除离群值，所有数据分组比较均用K-S检验(One sample Kolmogorov-Smirnov Test)作正态性验证，呈非正态分布数据用中位数和四分位数表示。所有组间比较的数据均采用两独立样本的非参数检验（Mann-WhitneyUTess），采用Spearman相关系数对数据相关性进行分析。以参考分布的2.5%和97.5%百分位数为参考下限和上限，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 数据分布 剔除12例离群值后，最终有效统计数据为1 047例，男性573例，女性474例，平均年龄为48.2岁。按年龄分为三组，青年组387例，中年组516例，老年组144例，经K-S检验显示血清维生素B6和B7水平均呈非正态分布（均P<0.01）。

2.2 不同性别﹑不同年龄组间健康成年人血清维生素B6和B7水平的比较 健康成年男女血清维生素B6水平分别为3.64(2.76～5.15)，3.34(2.55～4.59)和B7水平分别为0.22(0.14～0.34)ng/ml, 0.20(0.13～0.33)ng/ml，差异有统计学意义（Z=2.624，P<0.01；Z=2.196，P<0.05），且男性均高于女性。为了考察年龄对血清维生素B6和B7水平的影响，将1 047例健康成年人按年龄分为三组，各年龄组间血清维生素B6和B7水平的差异均无统计学意义（Z=0.800～1.817，均P>0.05），故无需划分年龄组，见表2。经Spearman相关性分析，血清维生素B6和B7水平与年龄之间没有相关性（均P>0.05）。

2.3 参考区间的建立 采用百分位数法（P2.5～P97.5）确定血清维生素B6和B7参考区间，以2.5%和97.5%百分位数为参考下限和上限，血清维生素B6参考区间为男性1.50～19.78 ng/ml，女性1.47～20.31 ng/ml；血清维生素B7参考区间为男性0.03～1.25 ng/ml，女性 0.03～1.41 ng/ml。

2.4 参考区间的验证 纳入2022年3～4月在复旦大学附属华山医院检验科进行健康体检的成年男、女性各20例，分别检测血清维生素B6和B7水平，若超出参考区间的数据低于2个（10%），则通过验证；反之，验证不通过。鉴于验证的结果均分布在相应的参考区间之内，本研究所建立的参考区间具有实际意义，可以在临床使用和推广。

3 讨论

维生素B6和B7在维持生命活动诸如机体代谢、生理以及发育中发挥着关键作用，临床上血清维生素水平的监测亦受到更多的重视[6,10]。参考区间是解释患者检验结果的基本工具，建立参考区间应基于健康人群，并对性别、年龄和种族等关键因素进行分析，每组应不少于120例样本[9]。本研究1 047例健康成年体检者中男、女性比例为1.2∶1，每组样本量均大于120例，符合建立参考区间的标准。血清维生素B6和B7水平在不同性别间的差异有统计学意义（均P<0.05），且男性均高于女性。已有研究表明维生素B6水平存在性别差异[11-12]，可能是因为男性和女性的饮食习惯﹑激素水平以及代谢水平不同有关。三个年龄组间血清维生素B6和B7水平的差异无统计学意义（均P>0.05），且与年龄之间没有相关性，但是已有研究表明维生素B6水平和年龄呈负相关，且需要对年龄进行分组[11-12]，这可能与不同地区和不同种族有关。目前尚未见有研究表明成年人维生素B7水平与性别和年龄相关。最终将维生素B6按性别分为两组参考区间，男性为1.50～19.78 ng/ml，女性为1.47～20.31 ng/ml，若以试剂说明书提供的参考区间2.0～25.0 ng/ml为标准，阳性率为7.2%；以本研究的参考区间为标准，则阳性率为2.3%。维生素B7按性别分为两组参考区间，男性为0.03～1.25 ng/ml，女性为0.03～1.41 ng/ml，若以试剂说明书提供的参考区间0.2～3.0 ng/ml为标准，阳性率多达43.1%；以本研究的参考区间为标准，阳性率为1.7%，明显降低了误诊率。卢美红等[13]在南通地区健康人群血清神经元特异性烯醇化酶参考区间的调查中也发现与试剂说明书提供的参考区间差异较大，因此直接引用试剂说明书提供的参考区间可能并不适用于本地区人群。不同地区及不同人群的参考区间不完全一致，有必要进一步研究和验证以获得可靠的参考区间，有助于降低诊断的假阳性，避免误诊给患者造成不必要的心理和经济负担。维生素B6和B7是水溶性维生素，体内浓度高时可迅速从尿液排出，几乎不产生毒性。但有报道长期、大量应用维生素B6可致严重的神经病变，出现认知障碍、肢体无力和手足麻木等症状[14]。迄今尚未见有维生素B7中毒的报道，但是长期、大量服用维生素B7会干扰肌钙蛋白T和甲状腺激素的检测结果，导致急性心肌梗死漏诊和毒性弥漫性甲状腺肿误诊[15]。另外通过参考区间验证发现本参考区间适用于本地区临床，但是只针对上海地区的成年人，儿童和孕妇的参考区间还需进一步探讨。

综上所述，本研究使用UPLC-MS/MS方法初步建立了上海市成年人血清维生素B6和B7的参考区间，区域化的参考区间可进一步提高临床诊断准确性，为今后开展维生素B6和B7代谢、膳食摄入或补充剂、以及与疾病关系的研究奠定基础。