药物中N-亚硝胺类基因毒性杂质检测方法的研究进展

孔 璇

（天津市药品检验研究院，天津 300070）

1991 年 Ashby 等［1］首次提出了基因毒性的概念，将其定义为经过适当遗传毒性实验模型，例如细菌基因突变实验（Ames），证实其具有遗传毒性的杂质。痕量水平的基因毒性杂质即可使细胞产生体内诱变或基因突变，对人体遗传物质造成直接或间接的损伤，进而引起癌变、畸变等遗传毒性［2-3］。自缬沙坦事件发生以来，N-亚硝胺类基因毒性杂质受到了各国药品监督管理机构的高度关注。本文对N-亚硝胺类基因毒性杂质进行了概述介绍，同时整理了近年来国内外对药物中该类杂质的检测方法的研究进展。

1 N-亚硝胺类基因毒性杂质概述

1.1 N-亚硝胺类基因毒性杂质的化学结构 N-亚硝胺类化合物的结构简式为A2-N-N=O，其中A 为烷基、芳香基或氢原子。亚硝胺类基因毒性杂质是公认强致癌物之一［4-7］，并且随着脂肪链的缩短，其致癌风险呈增大趋势［8］。经查询世界卫生组织官网，癌症研究机构发布了致癌物质清单，其中N-亚硝胺类化合物包括N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二丙胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基二苯胺、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基吗啉等多种该类物质［9］。

1.2 N-亚硝胺类基因毒性杂质的毒理作用 N-亚硝胺类化合物的致癌性强，致突变性高，即使在痕量水平，也能造成 DNA 和染色体损伤［10-11］。N-亚硝胺类基因毒性杂质一旦被人体摄入，即通过细胞色素P450 酶迅速发生代谢活化，生成了具有活性的小分子醛和烷基，进而与DNA 和蛋白质结合［12-13］，而后经过一系列生化反应，生成的产物烷基鸟嘌呤，会引起细胞遗传突变［14］，可能会导致人体发生胃癌、肝癌等癌症［15］，该类物质的作用机理是破坏DNA 的复制和损伤机体蛋白质的结构。

1.3 国内外对N-亚硝胺类基因毒性杂质的规定及控制情况 《欧洲药典》［16］及美国食品药品监督管理局（FDA）［17］均明确规定了部分基因毒性杂质的限度。我国国家药典委员会于2019 年1 月23 日发布了《关于＜中国药典＞2020 年版四部通则增修订内容的公示》，新增内容“遗传毒性杂质控制指导原则审核稿”，指导药物基因毒性杂质的分类和控制，该指导原则现已新增至《中国药典》2020 年版四部通则 9306［18］。

自2018 年7 月缬沙坦事件发生后，N-亚硝胺类基因毒性杂质在全球受到广泛关注，多个国家的药品监管机构发布了血管紧张素受体拮抗剂（ARB）类药物中N-亚硝胺类杂质通用检查方法。随后在雷尼替丁、二甲双胍中均检测到微量的N-亚硝基二甲胺（NDMA），更加引起人们对N-亚硝胺类基因毒性杂质的关注［1］。欧洲药品质量管理局（EDQM）于 2020 年4 月7 日在其官网对外发布了N-亚硝胺分析通则的征求意见稿，并提供了3 种测定N-亚硝胺类基因毒性杂质的方法［12］。

我国国家药品监督管理局药品审评中心于2020 年5 月8 日发布了《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）》的通告（2020 年1 号）。

2 药物中N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测

自缬沙坦事件发生以及后续发酵以来，国内外各药品监督管理机构纷纷积极应对，出台了许多官方的N-亚硝胺类基因毒性杂质检测的相关规定和指导原则等。目前也有文献报道了原料药或药物制剂中N-亚硝胺类基因毒性杂质的检测方法。

2.1 高效液相色谱法（HPLC） HPLC 法具有高压、高效分离、高灵敏度分析速度和载液流速较快的特点，70%以上的有机化合物都可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析［19］。HPLC 法是药物分析中最普遍、最常用的方法［20］。

范婷婷等［21］建立HPLC 法测定缬沙坦中NDMA的含量，该方法以20%甲醇为溶剂，色谱柱为资生堂（现为大曹色谱）C18型，流动相为甲醇与水梯度洗脱，检测波长为228 nm，线性关系在0.003～1 μg/ml 浓度范围内良好（R2=1），检出限（LOD）为 0.001 μg/ml，定量限（LOQ）为 0.003 μg/ml，6 次重复进样精密度为 0.3%，缬沙坦样品的加样回收率为95.1%（n=3），相对平均偏差（RSD）为0.1%，12 h 内对照品溶液稳定。该方法试样前处理简单，准确度和精密度较高，普适性好，可应用于缬沙坦中NDMA 的检测。

Sayaka 等［22］建立 HPLC 法测定缬沙坦中的 NDMA，采用光电二极管阵列检测器（PDAD），在浓度0.011～7.4 μg/ml 范围内线性良好（R2＞0.999），LOD 为 0.008 5 μg/ml，LOQ 为 0.028 5 μg/ml，在测定缬沙坦的同时，也在西尼地平中检测出了NDMA。该方法准确度和精密度高，可用于缬沙坦原料药及制剂中NDMA 的快速筛查和定量检测。

2.2 液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS） 液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）广泛应用于药物、食品、环境、法医、临床等各个领域［23-24］，样品进样后首先经流动相进入色谱柱分离，然后进入二级质谱进行检测。质谱根据被测物的质荷比（m/z）进行检测，被测物在离子源转换成气相离子进入质谱，在三重四级杆中，一级质谱扫描特定范围离子或允许特定离子进入碰撞室，在碰撞室内分子离子碰撞裂解，形成子离子进入二级质谱，二级质谱扫描特定范围离子或允许特定离子进入检测器。LC-MS/MS 法可实现质量分离、结构鉴定、定性定量分析，具有自动化程度高、准确度高、选择性强、灵敏度高等优点［25］。

Sörgel 等［26］建立 LC-MS/MS 法测定沙坦类原料药中的NDMA 和N-亚硝基二乙胺（NDEA），采用大气压化学电离（APCI）源，该方法灵敏度高，可同时定量检测8 种沙坦类原料药中的NDMA 和NDEA，NDMA 的LOQ为 0.000 26 μg/ml，NDEA 的 LOQ 为 0.000 13 μg/ml，除了原料药样品，另外在坎地沙坦制剂中也检出了NDEA的存在。

袁松等［27］建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定奥美沙坦酯中7 个N-亚硝胺类基因毒性杂质，采用APCI 离子源正离子扫描，多反应监测（MRM）模式下，色谱柱为安捷伦poroshell PFP型（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流动相为 0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱，流速0.4 ml/min，柱温40 ℃；对7 个基因毒性杂质：NDMA、NDEA、N-亚硝基二丙胺（NDPA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）、N-亚硝基二丁胺（NDBA）、N-亚硝基乙基异丙基胺（NEIPA）、N-亚硝基-4-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）同时测定。7 种杂质浓度在 1～100 ng/ml 内线性关系良好（r＞0.995），LOD 范围为 0.02～0.19 ng/ml，LOQ 为 0.06～0.65 ng/ml，平均加样回收率为87%～106%。该方法灵敏度高，专属性强，可用于同时对奥美沙坦酯原料药中的7 种N-亚硝胺类杂质进行定量检测，可供该药物的品控参考。

袁松等［28］还建立了 UPLC-MS/MS 法测定氯沙坦钾和缬沙坦中的7 种N-亚硝胺类基因毒性杂质，采用APCI 离子源正离子扫描，MRM 监测模式，色谱柱为安捷伦Infinity Lab Poroshell 120 SB-AQ（3.0 mm×150 mm，2.7 μm），为了去除流动相中对NDBA 检测有干扰的杂质，在液相色谱仪的进样器与泵混合器之间连接鬼峰捕集柱，安捷伦 Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm），流动相为 0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱，流速0.5 ml/min，柱温50 ℃；对7个杂质：NDMA、NDEA 、NDPA、NDIPA、NDBA、NEIPA、NMBA 同时进行定量检测。氯沙坦为水溶系统，各杂质浓度在 1～100 ng/ml 内线性关系良好（r＞0.995），LOD 范围为 0.03～0.22 ng/ml，LOQ 为 0.09～0.76 ng/ml，平均加样回收率为79.0%～108.8%；缬沙坦为甲醇溶系统，各杂质浓度在1～100 ng/ml 内线性关系良好（r＞0.995），LOD 范围为 0.05～0.29 ng/ml，LOQ 为 0.17～0.95 ng/ml，平均加样回收率为81.0%～105.7%。该试验对3 批氯沙坦钾原料药和3 批缬沙坦原料药进行检测，均未检出上述7 种N-亚硝胺类杂质，12 h 内对照品溶液稳定，灵敏度高，精密度和重复性好，专属性强，可以用来同时对氯沙坦钾原料药和缬沙坦原料药中7 种N-亚硝胺类基因毒性杂质进行定量测定，可供以上两种化学药品的品控参考。

徐艳梅等［29］建立 LC-MS/MS 法检测厄贝沙坦原料药及制剂中3 种N-亚硝胺类基因毒性杂质。采用APCI 离子源正离子扫描，MRM 监测模式下，色谱柱为菲罗门 Kinete F5（3.0 mm×100 mm，2.6 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱，流速0.3 ml/min，柱温 40 ℃；对 3 个基因毒性杂质：NDMA、NDEA 和NMBA 进行定量检测。3 个N-亚硝胺类杂质浓度在0.26～32.0 ng/ml 内线性关系良好（r≥0.997 7），LOD范围为 0.080～0.310 ng/ml，LOQ 为 0.268～1.033 ng/ml，NDMA、NDEA 和NMBA 加样回收率分别为102.1%、98.1%和102.6%，对4 批厄贝沙坦原料药及3 批厄贝沙坦分散片制剂进行检测，均未检出3 种杂质，12 h 内对照品溶液稳定，日内精密度和日间精密度、重复性好，准确度高，可帮助该药物的质量控制。

刘博等［30］建立的液相-高分辨质谱联用（LC-HRMS）法，测定盐酸二甲双胍缓释片中7 种N-亚硝胺类基因毒性杂质，质谱采用电喷雾离子源（ESI），平行反应监测模式下，色谱柱为沃特世XSelect CSH C18（3.0 mm×150 mm，2.5 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱，流速0.3 ml/min，柱温30 ℃；对7种N-亚硝胺类基因毒性杂质：NDMA、NDEA、NDPA、NDIPA、NMBA、NEIPA、NDBA 同时进行定量检测。7 种杂质浓度在 1～100 ng/ml 内线性关系良好（r≥0.995），LOD范围为 0.3～0.5 μg/ml，LOQ 为 0.5～1.0 μg/ml，7 种杂质的加样回收率范围为在82.6%～111.4%。8 h 内加样供试液稳定，日内精密度、重复性好，准确度、灵敏度高；在3 批样品中均可能含有N，N-二甲基甲酰胺（DMF）假阳性干扰物的情况下，当设置质量偏差为5 μg/ml 时，应用该方法可以实现混合对照溶液中DMF 与NDMA 的分离，进而消除检验过程中的假阳性干扰影响，表明本方法具有很强的专属性，可用于盐酸二甲双胍缓释片的质量品质控制。

徐文峰［31］等建立的高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-Q-TOF-MS）法，测定氯沙坦钾及其复方制剂中的痕量杂质NMBA，采用四极杆飞行时间质谱，ESI 离子源，正离子模式下选择［M+H］+m/z 147.076 4 对NMBA 进行测定，色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流动相为 0.1%甲酸水溶液和乙腈梯度洗脱，流速0.3 ml/min，柱温30 ℃；NMBA 浓度在 5～100 ng/ml 内线性关系良好（r=0.995 6），LOD 为 1.0 ng/ml，LOQ 为 2.1 ng/ml，高、中、低 3 个浓度的平均加样回收率为89.2%，精密度试验和重复性试验RSD 均未超过10.0%。12 h 内加样供试液稳定，该方法前处理操作便捷，灵敏度高，3 批供试品（包括1 批氯沙坦钾片和2 批氯沙坦钾氢氯噻嗪片）中均未检出NMBA，可以更好地控制氯沙坦钾等ARB 类药物的质量。

2.3 气相色谱-质谱联用法（GC-MS） 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）广泛用于环境、食品、药品等领域中沸点低、可气化小分子有机化合物的检验检测［32］，气相色谱部分的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品经色谱柱分离后，先后进入质谱检测器中。在质谱中待测分子经离子源转化为离子，而后测量离子的质荷比（m/z）。在这类仪器中，由于质谱仪工作原理不同，又有气相色谱-四极质谱仪，气相色谱-飞行时间质谱仪，气相色谱-离子阱质谱仪等。GC-MS 法分析取样量少，可有气体和液体两种进样形式，灵敏度高，定性定量测定结果准确可靠［33-34］。

吴兆伟等［35］采用GC-MS 法测定缬沙坦中NDMA的含量，气相色谱柱为安捷伦DB-WAX UI 石英毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），载气为氦气，程序升温分离，电子轰击（EI）离子源，选择离子检测模式（SIM）监测，检测离子（m/z）：42、43、74 和 80，其中NDMA 定量离子（m/z）为 74，辅助定性离子（m/z）为42 和43，定量方法采用内标法，内标物为NDMA-d6，内标定量离子（m/z）为 80。NDMA 浓度在 3～300 ng/ml内线性关系良好（r=0.999 9），LOD 为1 ng/ml，LOQ 为3 ng/ml，试样加标回收率为103.2%。该方法测定了来自2 个厂家共9 批缬沙坦原料药样品，其中一厂家样品未检出，另一厂家样品NDMA 含量为0.08～0.14 μg/g。12 h 内供试品溶液内标物稳定，前处理步骤简单，精密度和重复性好，灵敏度和准确性高，可应用于生产缬沙坦原料药的质量控制。

姜俊等［36］采用顶空GC-MS 法检测厄贝沙坦原料药中的NDMA 和NDEA，气相色谱柱为岛津H-Rtx-Wax（0.25 mm×30 m，0.5 μm），载气为氮气，程序升温分离，EI 电离源，SIM 模式监测，NDMA 和 NDEA 的特征离子分别为74.00 和102.00。两种杂质浓度在10～500 ng/ml 内线性关系良好（R2＞0.999），LOD 分别为 1.7 ng/ml 和 4.5 ng/ml，LOQ 分别为 5.2 ng/ml 和13.7 ng/ml，阴性及阳性样品加标回收率为100.6%～108.7%。该方法精密度好，准确度高，能够有效地用于厄贝沙坦原料药中NDMA 和NDEA 的检测。

葛雨琦等［12］建立气相色谱串联三重四极杆质谱（GC-MS/MS）法，测定厄贝沙坦制剂中9 种N-亚硝胺基因毒性杂质，气相色谱柱为岛津VF-WAXms（0.25 mm×30 m，0.5 μm），载气为高纯氦，程序升温分离，EI 离子源，MRM 模式监测；该方法以NDMA-d6和NDPA-d14为内标，可同时测定厄贝沙坦制剂中NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二苯胺、N-亚硝基二苄胺、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基吗啉9 种杂质。9 种杂质浓度在5.0～283.1 ng/ml内 线 性 关 系 良 好，LOD 为 0.1 ～20.6 ng/ml，LOQ 为0.3～78.3 ng/ml。平均加样回收率为81.43%～123.2%，该报道检测了多种厄贝沙坦制剂，包括厄贝沙坦片、厄贝沙坦分散片、厄贝沙坦氢氯噻嗪片、厄贝沙坦氢氯噻嗪分散片、厄贝沙坦胶囊和厄贝沙坦氢氯噻嗪胶囊等，检出NDEA、N-亚硝基吗啉和N-亚硝基二苯胺，检出量为 NDMA 0.11～0.54 μg/g，N-亚硝基吗啉 0.1～0.17 μg/g，N-亚硝基二苯胺 0.11～1.95 μg/g，值得注意的是，后两者均为首次检出。该方法灵敏度高、准确度好，可帮助加强厄贝沙坦制剂的市场监管，为其质量控制提供参考。

周刚等［1］采用 GC-MS/MS 法，建立阿莫西林原料药中12 种N-亚硝胺类化合物含量测定的方法，气相色谱柱为安捷伦VF-WAXms（0.25 mm×30 m，0.25 μm），载气为高纯氦，程序升温分离，EI 离子源，时间选择反应扫描模式（T-SRM）监测，数据采集模式为一级质谱采集母离子，定量定性分析采用二级质谱监测子离子。该方法对12 种N-亚硝胺类基因毒性杂质：NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基-N-甲基苯胺、N-亚硝基-N-乙基苯胺、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二苯胺和N-亚硝基二苄基胺同时进行定量检测，12 种杂质浓度在0.5～200 ng/ml 内线性关系良好（r＞0.998），LOD 范围为 0.033～0.481 ng/ml，LOQ 范围为0.110～1.604 ng/ml，供试品用二氯甲烷溶解提取，试样加标回收率在为78.5%～106.6%。所建立的GCMS/MS 测定法操作简便，专属性好，灵敏度高，精密度和重复性好，应用前景良好，为阿莫西林原料药的生产质量控制提供参考。

王璐等［37］建立了GC-MS 法测定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中的NDMA 和NDEA。色谱柱为安捷伦DBWAX 毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.5 μm），程序升温，载气为氦气，EI 电离源，MRM 模式监测。NDMA 浓度在0.922 2～46.109 3 ng/ml 内线性关系良好（r=0.998 3），NDEA 浓度在 0.235 6～411.781 0 ng/ml 内线性关系良好（r=0.999 8），LOD 分别为 0.139 00 ng/ml 和0.045 83 ng/ml，LOQ 分别为 0.6177 ng/ml 和 0.258 4 ng/ml，平均加样回收率分别为96.82%和95.93%。该方法测定了3 批芬地柞酸左旋氯哌斯汀原料药，均未检出NDMA 和NDEA，15 h 内加标供试品溶液稳定，结果准确度、灵敏度高，精密度和重复性好，耐用性好，可用于该品种原料药生产的品控参考。

韩勇等［38］建立了GC-MS/MS 法测定缬沙坦氢氯噻嗪制剂中NDMA 和NDEA。色谱柱为赛默飞TGWAXMS 毛细管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），程序升温，载气为氦气，EI 离子源，MRM 模式监测。NDMA和 NDEA 浓 度 分 别 在 0.54 ～108.99 ng/ml 与 0.20 ～100.00 ng/ml 内线性关系良好（r=0.999 9，r=0.999 8），NDMA 的 LOD 为 0.22 ng/ml，NDMA 和 NDEA 的LOQ 分别为0.54 ng/ml 和0.20 ng/ml，平均加样回收率分别为101.6%和102.0%。该方法对18 批缬沙坦氢氯噻嗪制剂（来源于4 家生产企业，3 种剂型）进行了检测，均检出了NDMA，部分批次检出NDEA。8 h内加标供试品溶液稳定，样品制备过程简单，精密度和重复性好，专属性好，灵敏度和准确度高，有助于缬沙坦氢氯噻嗪制剂中基因毒性杂质的控制。

徐小力等［39］建立GC-MS 法测定不同厂家盐酸二甲双胍缓释片中的NDMA。色谱柱为安捷伦VFWAXms（0.25 mm×30 m，0.25 μm）毛细管柱，载气为氦气，EI 离子源，程序升温，MRM 模式监测。NDMA 在0.25～50.00 ng/ml 浓度内线性关系良好（r=0.999 9），LOD 为0.25 ng/ml，加样平均回收率为107.79%。该方法测定了目前市场上31 家厂家的盐酸二甲双胍缓释片（共75 批）的NDMA 含量，部分批次有检出。24 h内对照品溶液稳定，精密度和重复性好，操作简单、灵敏度和准确度高，具有良好的应用前景，可用来帮助生产盐酸二甲双胍缓释片的质量控制。

3 展望

基因毒性杂质存在于多类药品中，相比较于其他药物杂质，即使是人体痕量摄入即可损伤机体遗传物质，不言而喻，对服药者（尤其长期服药者）的危害性十分严重。而被世卫组织列入致癌物清单中的8 种N-亚硝胺类基因毒性杂质更是具有高致突变性和强致癌性。近年来的相关检测方法的研究报道虽然不够成熟，但此类研究发展迅速，足以证明其在药物分析专业界的重要程度。早期的文献报道涉及的N-亚硝胺类基因毒性杂质较少，主要为NDMA 和NDEA，近来随着研究的深入，越来越多的此类杂质可被新颖的方法同时检测，方法灵敏度也大有提高。按照目前的研究趋势显示，越来越多种潜在的N-亚硝胺类基因毒性杂质被检出的可能性非常大，所以开发不同原料药及制剂剂型中该类杂质的检测的分析方法依然迫在眉睫。