伏立诺他协同NVP-BEZ235诱导人外周血白血病T细胞凋亡探究

陈 明，肖 红

(湖南省湘潭市第一人民医院血液科，湖南 湘潭 411101)

急性T淋巴细胞白血病是一种常见的造血系统的恶性肿瘤，预后较差[1]。PI3K/Akt是与血液系统肿瘤密切相关的信号通路。研究证明，在急性T淋巴细胞白血病中的PI3K/Akt异常活化[2]。临床证实，针对PI3K/Akt的靶向治疗能够有效延缓肿瘤的发生发展[3]。NVP-BEZ235是一种新型 PI3K信号通路抑制剂，能够抑制急性T淋巴细胞白血病[4]。伏立诺他是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，现已广泛用于治疗白血病，能够协同卡非佐米和贝沙罗汀等抑制T细胞白血病细胞[5]。研究伏立诺他联合NVP-BEZ235用药诱导人外周血白血病T细胞(Jurkat细胞)凋亡及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人外周血白血病T细胞(Jurkat细胞)购自中国典型培养物保存中心。伏立诺他和NVP-BEZ235购自默克公司。鼠抗人抗体β-actin抗体、鼠抗人Bim1抗体购自Santa Cruz公司。鼠抗人total-FOXO3a抗体、鼠抗人磷酸化FOXO3a抗体、鼠抗人total-Akt抗体和鼠抗人磷酸化Akt抗体购自Cell signaling公司。siRNA由广州瑞博合成。

1.2 细胞培养和凋亡检测

将Jurkat细胞接种到含0.1 g/L链霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，放置到5% CO2、37℃恒温条件培养。将生长旺盛的Jurkat细胞浓度调整为3×105个/mL，继续培养24 h。用伏立诺他(0.48 μmol/L)、NVP-BEZ235组(24 nmol/L)联合用药(0.48 μmol/L伏立诺他+24 nmol/L NVP-BEZ235)及阴性对照(等体积DMSO)处理48 h。使用流式细胞仪技术，检测用药后Jurkat细胞的凋亡情况。

1.3 Western blot 检测蛋白表达及磷酸化

收集各组细胞并用蛋白提取试剂裂解，将蛋白提取物用14 000 rpm离心15 min，进行SDS-PAGE，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜。使用含5%脱脂奶粉的TBST溶液进行封闭，加入一抗，4℃过夜孵育。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，放入室温条件下孵育，进行显影，拍照。

1.4 免疫荧光检测FOXO3a核转位

将Jurkat细胞用药，在24孔板中用4%的多聚甲醛固定30 min。PBS洗涤后，用每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100作用10 min，PBS洗涤后每孔加入500 μL DMEM+10% FBS，孵育1 h，PBS洗涤1次，用抗FOXO3a抗体，孵育1 h，再加入稀释好的荧光标记二抗，封片，拍照。

1.5 细胞转染

将细胞培养到50%～95%，将siRNA和lipofectmine2000混匀，将DNA-脂质体复合物与细胞混匀，在5%CO2中37℃孵育5 h，转染24 h后，Western blot鉴定转染效果。对细胞进行用药，并检测细胞活性。

2 结果

2.1 伏立诺他协同NVP-BEZ235诱导Jurkat细胞的凋亡

为检测伏立诺他及NVP-BEZ235能否诱导Jurkat细胞发生凋亡，利用流式细胞技术测定细胞的凋亡情况。结果发现，加入NVP-BEZ235处理48 h能够明显引起细胞凋亡，同时伏立诺他也在一定程度上诱导Jurkat细胞凋亡，但当伏立诺他及NVP-BEZ235联合用药，凋亡比例明显高于NVP-BEZ235组(图1)，这表明伏立诺他可能协同增加NVP-BEZ235诱导Jurkat细胞凋亡。

图1 伏立诺他协同NVP-BEZ235诱导Jurkat细胞发生凋亡Fig.1 Jurkat cell apoptosis induced by vorinostat combined with NVP-BEZ235

2.2 伏立诺他协同NVP-BEZ235对核转录因子FOXO3a磷酸化的影响

为检测伏立诺联合NVP-BEZ235用药是否影响FOXO3a的活性，检测了联合用药后FOXO3a的磷酸化情况。结果显示，Jurkat细胞中的FOXO3a有磷酸化，但是NVP-BEZ235或伏立诺他处理能够抑制FOXO3a磷酸化水平，联合用药后，FOXO3a的磷酸化水平进一步降低(图2)。

图2 伏立诺他协同NVP-BEZ235抑制FOXO3a磷酸化Fig.2 Phosphorylation of FOXO3a restrained by vorinostat combined with NVP-BEZ235

2.3 伏立诺他协同NVP-BEZ235诱导FOXO3a转位

进一步研究了伏立诺他协同NVP-BEZ235处理对FOXO3a转位的影响。实验结果表明，单独的NVP-BEZ235或伏立诺他都能增加细胞核中FOXO3a的含量，且两者联合用药后，细胞核中FOXO3a明显高于单独组，表明伏立诺他联合NVP-BEZ235能诱导FOXO3a核转位(图3)。

图3 伏立诺他协同NVP-BEZ235诱导FOXO3a核转位Fig.3 FOXO3a translocation induced by vorinostat combined with NVP-BEZ235

2.4 伏立诺他和NVP-BEZ235通过FOXO3a增加Bim1表达

使用siRNA将FOXO3a沉默，Western blot检测结果发现，Bim1表达明显降低(图4 A)。利用siRNA抑制Bim1的表达，能逆转伏立诺他及NVP-BEZ235的抑制效果(图4B)，证明伏立诺他联合NVP-BEZ235通过FOXO3a诱导Bim1表达，从而诱导Jurkat细胞发生凋亡。

A：沉默FOXO3a对Bim1表达的影响；B：沉默Bim1对细胞活性的影响，组间比较，*P<0.05图4 伏立诺他和NVP-BEZ235通过FOXO3a诱导Bim1表达Fig.4 Bim1 expression induced by vorinostat combined with NVP-BEZ235 through FOXO3a

3 讨论

伏立诺他是已经批准用于治疗T细胞淋巴瘤的一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可能的作用机制为增强蛋白的乙酰化，改变染色质状态，诱导肿瘤细胞分化。NVP-BEZ235主要通过阻断PI3K的活性来显著降低mTOR的激活，能够抑制多种肿瘤细胞，且与硼替佐米及阿霉素等药物也具有协同效应。本研究证实伏立诺他能够协同NVP-BEZ23诱导Jurkat细胞的凋亡[4]。

叉头框蛋白(forkhead box protein，FOX)是参与细胞增殖分化的一类蛋白家族，其中FOXO3a与多种细胞生长增殖的基因表达有关。FOXO3a转录调因子的活性主要与磷酸化修饰相关，当FOXO3a发生磷酸化后，由胞核转移到细胞质中，从而抑制转录活性[6]。本研究发现，静息状态下的Jurkat细胞中的FOXO3a主要位于细胞浆内，且呈磷酸化状态，但是加入NVP-BEZ235和伏立诺他处理后，可降低FOXO3a的磷酸化，同时发现细胞核内的FOXO3a含量升高，说明FOXO3a发生了核转位。

Bim1是Bcl-2家族中的一员，与肿瘤的发展密切相关，抑制Bim1表达，可显著降低抗肿瘤药物的杀伤作用。抗肿瘤药物可以通过Bim1诱导肿瘤细胞的凋亡，干扰了FOXO3a表达后发现，Bim1的表达明显减少。采用siRNA干扰Bim1的表达，伏立诺他和NVP-BEZ235对细胞的促凋亡效应也明显减弱，证实FOXO3a/Bim1可能参与了伏立诺他及NVP-BEZ235诱导Jurkat细胞发生凋亡。

伏立诺他和NVP-BEZ235联合用药能够诱导Jurkat细胞凋亡，两者可激活Jurkat细胞的核转录因子FOXO3a，上调促凋亡分子Bim1，从而诱导凋亡。