香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

李声平，马亮，闫天慧，艾晓辉，董靖

中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种宿主广泛的条件性致病菌，可在人和动物，尤其是水生动物中引起多种疾病[1］，如斑点叉尾鮰的套肠病[2］、鳖白点病和白底板病[3］、鲤出血病[4］等，均会造成养殖业的重大经济损失[5］。在水产养殖中，嗜水气单胞菌感染主要依赖化学抗菌药物进行防控，而药物的不规范使用导致菌株出现耐药性[6］。此外，药物在鱼体内的蓄积和残留，会对食用的人群产生安全隐患[7］。近年来，依据干预细菌感染过程的思路，诞生了多种抗菌药物研发的新策略，其中抗毒力策略可作为抗嗜水气单胞菌感染药物研发的新途径[8］。

嗜水气单胞菌能分泌气溶素、溶血素和肠毒素等多种毒力因子，其致病力与这些毒力因子密切相关[9］。气溶素是嗜水气单胞菌的主要毒力因子之一，可以引起红细胞发生溶血现象，对细胞也有毒性作用，可作为鉴别致病菌株的重要标志[10］。有研究发现，气溶素基因缺失型嗜水气单胞菌的致病性显著低于野生型菌株[11］。因此，气溶素可作为抗嗜水气单胞菌感染药物研发的新靶标。

香叶木素主要存在于菊花、薄荷等中草药以及柑橘类水果中，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理学活性[12］。目前香叶木素对嗜水气单胞菌致病力的影响鲜有报道。本研究通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹和荧光定量PCR等试验分析了香叶木素抑制嗜水气单胞菌气溶素表达的机制，通过活/死细胞染色研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素介导的细胞毒性的保护作用，旨在为以毒力因子为靶标的抗嗜水气单胞菌感染药物研发提供新的思路和候选化合物。

1 材料与方法

1.1 试验材料

香叶木素（纯度≥98%）购自四川维克奇生物科技有限公司；嗜水气单胞菌XS-91-4-1 由中国科学院水生生物研究所李爱华研究员赠送；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自鼎国生物公司；兔抗气溶素多克隆抗体由笔者所在实验室制备；活/死细胞双染色试剂盒购自翌圣生物公司。香叶木素用DMSO制备成40.96 mg/mL母液，备用。

1.2 最小抑菌浓度(MICs)测定

采用肉汤微量稀释法在96孔板中测定香叶木素和恩诺沙星对嗜水气单胞菌XS-91-4-1 的MICs[13］，挑取XS-91-4-1 单菌落至LB 液体培养基培养过夜（28 ℃），180 r/min 离心收集菌体，用无菌PBS 洗涤3 次后重悬至浓度约为1.5×108CFU/mL。在96孔板中将药物倍比稀释，使香叶木素和恩诺沙星的质量浓度范围分别为512~1 μg/mL 和64~0.125 μg/mL，每孔中药物体积为100 μL；向每孔中加入稀释好的菌液100 μL，使其终浓度为5×105CFU/mL。分别设置阳性和阴性对照组，阳性对照组只加菌不加药，阴性对照组只加新鲜LB培养基。将96孔板置于恒温培养箱中，28 ℃静置培养过夜，以细菌未生长的最小药物浓度定为药物的MIC。

1.3 生长曲线测定

将过夜的XS-91-4-1 菌液按1%接种于新鲜LB液体培养基中，28 ℃振荡培养至OD600nm=0.3，分装于50 mL 锥形瓶中，加入不同质量浓度的香叶木素，使药物终质量浓度分别为4、8、16、32 μg/mL。只加DMSO 组作为无药物处理组。在28 ℃继续培养5 h，每0.5 h测1次OD600nm的吸光值。

1.4 溶血试验

将菌株XS-91-4-1 接种于LB 液体培养基中，28 ℃振荡培养至OD600nm=0.3，并分装于50 mL锥形瓶中。向每瓶中加入香叶木素，使菌液中香叶木素的终质量浓度为0、4、8、16、32 μg/mL。在28 ℃摇至OD600nm=1.5 时，高速离心（13 300 r/min，1 min）收集上清液冻存备用。将上清液中加入胰蛋白酶（20 μg/mL）激活气溶素，用于溶血和免疫印记试验[14］。溶血试验反应体系如下：875 μL 的溶血缓冲液，100 μL 已激活的上清液，5×106个脱纤维绵羊红细胞（25 μL）。反应体系充分混匀后置于37 ℃培养箱中孵育15 min。反应结束后以13 300 r/min 离心1 min，取上清液测定OD543nm的吸光值。以不加药物上清液为100%溶血对照，试验组测得吸光度与阳性对照组的比值为溶血百分比。

1.5 免疫印迹试验

将本文材料与方法“1.4”中胰蛋白酶处理的菌液上清用于蛋白免疫印迹试验。上清液经样品制备后进行SDS-PAGE 电泳分离目标蛋白，然后通过湿法将蛋白转印至PVDF 膜上；用5%脱脂奶粉将PVDF膜封闭2 h；兔抗气溶素多克隆抗体（1∶1 000）室温孵育1 h；TBST 洗涤3 次后用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶4 000）孵育1 h；TBST 洗涤3 次；加入ECL 发光液避光孵育3 min 后，用凝胶成像系统进行化学发光观察并拍照。

1.6 荧光定量PCR

菌株培养方法同本文材料与方法“1.4”。菌株XS-91-4-1 与不同质量浓度的香叶木素在28 ℃振荡培养至OD600nm=1.5 时，13 300 r/min 离心1 min 保留菌体用于提取细菌总RNA。将总RNA 加入到反转录试剂中合成cDNA 并用于后续的荧光定量PCR反应，每个浓度试验组重复3 次。荧光定量PCR 试验所用到的引物序列见表1，16S rRNA 为内参基因。试验数据用2−ΔΔCt法进行分析，计算不同质量浓度香叶木素处理后aerA基因的相对表达量。

表1 试验中使用的引物Table 1 Primer pairs used in test

1.7 细胞毒性试验

将人非小细胞肺癌细胞（A549）接种至含有10%的胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养基的细胞培养瓶中，37 ℃含5%CO2培养箱中传代培养。当细胞长满瓶底80%时，弃去旧培养基，用无菌PBS 洗3 次后，加胰蛋白酶消化3~5 min 后重悬细胞。向96 孔板中加入细胞，使其终浓度为2.5×105个/孔，继续培养16~18 h 使细胞完全贴壁。按本文材料与方法“1.4”收集菌液上清，经0.22 μm 滤膜过滤除菌后加入到每孔中。菌液上清与细胞共孵育2 h 后弃去上清液，用无菌PBS洗涤3次，加入活/死细胞双染色试剂反应30 min后用荧光显微镜拍摄图像。

2 结果与分析

2.1 香叶木素对嗜水气单胞菌生长的作用

根据MICs试验可知，香叶木素和恩诺沙星对嗜水气单胞菌XS-91-4-1的MIC分别为512和4 μg/mL，通过添加DMSO 到阳性对照组发现DMSO 对细菌生长没有影响。此外，通过生长曲线试验发现，4~32 μg/mL 的香叶木素与嗜水气单胞菌共培养不影响嗜水气单胞菌的生长（图1）。综上，香叶木素在本研究的试验条件下对嗜水气单胞菌的生长没有抑制作用，几乎不会对嗜水气单胞菌造成选择性压力。

图1 嗜水气单胞菌与香叶木素共培养的生长曲线Fig.1 Growth curves of A.hydrophila co-cultured with diosmetin

2.2 香叶木素对嗜水气单胞菌上清液溶血活性的抑制作用

由图2可知，香叶木素可剂量依赖性地降低嗜水气单胞菌上清液的溶血活性；当香叶木素质量浓度分别为4、8、16和32 μg/mL 时，其上清液溶血量分别为63.20%、48.62%、41.96%和24.46%。当香叶木素质量浓度在4 μg/mL 及以上时，能显著抑制上清液中溶血活性。该结果提示，香叶木素可能通过抑制气溶素的表达或活性发挥作用。

图2 香叶木素对嗜水气单胞菌上清液溶血的抑制作用Fig.2 Impact of diosmetin on hemolytic activity of bacterial supernatants

2.3 香叶木素对气溶素表达的影响

蛋白免疫印迹试验结果如图3所示，随着香叶木素质量浓度的增加，嗜水气单胞菌上清液中气溶素的含量逐渐下降，当香叶木素质量浓度达到32 μg/mL时，上清液中几乎检测不到气溶素。该结果表明，香叶木素与嗜水气单胞菌共培养后可剂量依赖性地降低气溶素的表达。

图3 不同质量浓度香叶木素处理后培养物上清液中气溶素的含量Fig.3 Amount of aerolysin in bacterial supernatants after a co-incubation with diosmetin at different concentrations

2.4 香叶木素对aerA基因转录的抑制作用

荧光定量PCR 试验结果如图4 所示，与未加药物组相比，香叶木素处理组气溶素编码基因aerA的转录水平呈剂量依赖性降低。当香叶木素质量浓度分别为4、8、16 和32 μg/mL 时，aerA的转录水平分别下调至无药物处理组的50.42%、26.33%、11.94%和11.04%。与未加药对照组相比，8 μg/mL 及以上香叶木素处理的嗜水气单胞菌，其aerA的转录显著下降。

图4 香叶木素处理后嗜水气单胞菌aerA基因的转录水平Fig.4 Transcription levels of aerA genes in A.hydrophila treated with diosmetin

2.5 香叶木素对气溶素介导的细胞损伤的保护作用

如图5A 所示，未经处理的细胞为活细胞，被染成绿色；而无药物上清处理的细胞出现了大量死亡，被染成红色（图5B）；与无药上清处理组相比，含有32 μg/mL 香叶木素的上清液与细胞共培养后，死亡细胞减少（图5C），与未处理组相当。该结果表明，香叶木素可减少气溶素介导的细胞损伤。

图5 香叶木素对气溶素介导的细胞损伤的保护作用Fig.5 Protective effect of diosmetin against aerolysin mediated cell injury

3 讨 论

香叶木素是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎抑菌作用[15］。Meng 等[16］从皱叶绢毛苣中分离到了香叶木素，并研究了其对常见细菌的最小抑菌浓度，结果发现香叶木素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌的MIC分别为50、50、100 和50 μg/mL，而对白色念珠菌和红色毛藓菌的MIC 大于100 μg/mL。Li等[17］通过研究发现香叶木素能改变小鼠肠道菌群结构，从而提高其肠道的功能。Gomez-chang 等[18］研究发现香叶木素在低至3.9 μg/mL 时，即可抑制91.94%的幽门螺杆菌的生长。目前香叶木素抑制水产源病原菌的研究较少，马亮等[19］发现香叶木素可抑制克氏原螯虾源普通变形杆菌的生长，其MIC 为256 μg/mL。本研究发现香叶木素在质量浓度高达512 μg/mL 时才能抑制嗜水气单胞菌生长，提示其几乎没有抑制嗜水气单胞菌生长的作用。此外，通过生长曲线发现，香叶木素质量浓度为32 μg/mL 及以下时，对嗜水气单胞菌的生长无影响。

Chan 等[20］发现香叶木素能通过抑制金黄色葡萄球菌的丙酮酸激酶的活性，导致其ATP缺乏，从而提高其抗菌作用。而我们通过溶血试验发现，香叶木素能降低嗜水气单胞菌上清液的溶血活性，从而降低嗜水气单胞菌的毒力。且相比于Sun 等[21］研究的七叶苷在25 μg/mL 时能显著减少嗜水气单胞菌上清液的溶血活性，香叶木素在4 μg/mL 时也能达到同样效果，提示香叶木素的试验效果要优于七叶苷。本研究进一步通过Western-blot 试验和荧光定量PCR 试验，验证了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素的抑制效果。这与Dong 等[22］研究的百里香酚能够抑制嗜水气单胞菌溶血活性和气溶素表达，具有类似的效果，但百里香酚的机制是通过抑制嗜水气单胞菌的群体感应从而降低气溶素的表达和生物被膜形成，香叶木素仅抑制aerA的转录，对群体感应的相关基因的表达并没有影响。Liu等[23］研究发现，香叶木素能在亚抑制浓度下抑制金黄色葡萄球菌的α-溶血素的表达，从而降低α-溶血素对A549 细胞的损伤。而本试验也发现香叶木素对气溶素介导的A549细胞损伤也具有明显的保护效果。以上发现提示，香叶木素可作为治疗嗜水气单胞菌感染的潜在药物。