基于生物信息学分析FOXO4在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

吴承帅 陈兵海

肾细胞癌是泌尿系统中次于膀胱癌的常见恶性肿瘤。肾细胞癌中以肾透明细胞癌最常见，故通常以肾癌简称。肾癌对传统放化疗的敏感性低，手术切除仍是局部肾癌的主要治疗方法。然而，高达40%的局部肾癌在手术切除后最终仍可发展为转移性肿瘤[1]。尽管多种靶向药物已广泛应用于肾癌患者的治疗，但患者的中位生存时间依旧低于预期[2]。因此，迫切需要寻找肾癌早期诊断的标志物和治疗的靶标。

叉头框蛋白 O4（forkhead box protein O4,FOXO4）是FOXO家族的一员，可参与细胞能量代谢调节及细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。在前列腺癌、胃癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、胶质瘤等肿瘤组织中的表达明显低于正常组织，且FOXO4表达水平与这些肿瘤的进展或预后密切相关[3-9]。Wang等[10]用肾癌组织与正常组织检测FOXO4 mRNA和蛋白表达水平，结果显示FOXO4 mRNA和蛋白表达水平均较正常组织明显降低，并通过调节Bim而诱导肾癌细胞凋亡。然而，FOXO4在肾癌中的其他作用及预后价值尚不清楚。因此，本研究利用在线数据库中更大样本分析FOXO4表达水平，并探讨FOXO4对肾癌细胞生存能力的影响，分析其表达与临床预后的关系及表达调控机制，为进一步研究FOXO4在肾癌发生、发展中的作用和机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 Oncomine数据库可视化分析肾癌中FOXO4的表达 Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/）是一个可用于检索基因表达的公共数据资源库[11]。首先，在搜索框中输入FOXO4，对FOXO4基因在不同癌症类型（cancer vs.normal）中的mRNA表达进行可视化分析。阈值条件设置如下：P值为0.05，fold change为all，gene rank为top 10%，date type为 all。随后，对FOXO4在肾癌的4个芯片数据集（包括Gumz Renal Statistics、Lenburg Renal Statistic、Jones Renal Statistics、Beroukhim Renal Statistics）中的mRNA表达进行可视化分析。肾癌样本和相应正常肾组织样本的数量、差异倍数和P值都在可视化结果中显示。

1.2 UALCAN数据库分析肾癌中FOXO4 mRNA和蛋白表达水平 UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）是一个用于分析肿瘤数据的交互式网络资源库[12]。基于肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,CPTAC）数据库的数据，运用UALCAN平台对肾癌样本和正常肾组织样本中FOXO4 mRNA和蛋白表达进行分析和可视化。具体如下，选择UALCAN中的“TCGA analysis”工具，在搜索框中输入FOXO4，根据个体癌症分期和肿瘤分级，评估FOXO4在所有肾癌样本和不同亚组中肾癌样本中的mRNA表达水平。类似地，使用UALCAN的“CPTAC analysis”工具，在搜索框中输入FOXO4，根据样本类型评估FOXO4在肾癌样本中的蛋白表达水平。

1.3 细胞培养 769-P、786-O肾癌细胞系及HEK293T细胞均源自美国模式培养物集存库。HK-2肾小管上皮细胞及其HK-2专用基础培养基均购自上海中乔新舟生物科技有限公司。肾癌细胞系用1640完全培养基培养，而HEK293T细胞用DMEM完全培养基培养。完全培养基由10%FBS、1%青霉素-链霉素混合液及无血清培养基配制而成。FBS和无血清培养基均购自南京福麦斯生物科技有限公司，青霉素-链霉素混合液购自上海生工生物工程有限公司。所有细胞均培养于37℃，5%CO2的孵育箱中。

1.4 FOXO4 mRNA表达水平检测 采用RT-qPCR法。根据组织/细胞RNA快速提取试剂盒（上海超研生物科技有限公司）说明书提取细胞总RNA，应用紫外分光光度仪检测总RNA的浓度和纯度。按照逆转录试剂盒和PCR试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）说明书进行逆转录和基因扩增。逆转录反应条件为：50℃ 15 min，85℃ 2 min；PCR反应条件为：95℃ 30 s，95℃10 s，60℃30 s，循环次数设为40。熔解曲线用于评估引物的特异性，其程序条件为：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceralde-3-phosphata dehydrogenase,GAPDH）为内参基因 。FOXO4引 物序 列 ：上 游 5'-CAGCCCTTCAGCCTATTCAG-3'， 下 游 5'-CTTGCCCAGCAAGAACTAGG-3'；GAPDH 引物序列：上游5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'， 下 游 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 计 算FOXO4相对表达水平。荧光定量PCR仪（型号：QuantStudio 5）购自美国Applied Biosystems公司。

1.5 FOXO4过表达 采用CRISPR/dCas9方法使FOXO4过表达[13]。具体如下，遵照SanPrep去除内毒素质粒提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）说明书提取MPH、dCas9、REV、GAG、VSVG和MS2-sgRNA-FOXO4质粒。REV、GAG和VSVG用于构建慢病毒载体，它们的质量比为：REV∶GAG∶VSVG=1 714 ng∶857 ng∶429 ng。随后，应用转染实验分别在HEK293T细胞中构建Lenti-MPH、Lenti-dCas9和Lenti-FOXO4，且使它们相继转染到肾癌细胞系（769-P和786-O）。设置769-P和786-O细胞同时过表达MPH、dCas9后为对照组，再以对照组为基础过表达FOXO4后为实验组即FOXO4（+）。采用RT-qPCR法检测转染细胞中FOXO4 mRNA表达水平，选择稳定过表达FOXO4的细胞作进一步研究。

1.6 细胞存活能力检测 采用溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）法。收集实验组FOXO4（+）和对照组对数生长期细胞并用细胞计数板进行计数。将5×103个细胞接种于96孔板中，放置在37℃培养箱中培养0、24、48、72 h。随后，将20 μl MTT（上海生工生物工程有限公司）试剂加入板中，将细胞与MTT试剂溶液（5 mg/ml）共同孵育4 h。接着将细胞与200 μl二甲基亚砜一起孵育10 min后，在酶标仪上测量每个孔在570 nm处的吸光度值。酶标仪（型号：MULTISKAN GO）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.7 FOXO4表达与肾癌预后的关系 Kaplan-Meier plotter在线数据库（http://kmplot.com/）用于评估大量基因表达对21种肿瘤预后的影响，包含530个肾透明细胞癌样本[14]。本研究利用该数据库来评估FOXO4表达在肾癌中的预后价值。根据FOXO4 mRNA表达的中位值和自动选择最佳截断值将肾癌样本分为高表达组（227个样本）和低表达组（303个样本），通过Kaplan-Meier方法和log-rank检验分析FOXO4表达与总生存期（overall survival,OS）之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.8 预测和分析调节FOXO4在肾癌中表达的miRNA研究表明FOXO4在许多肿瘤类型中的表达受miRNA调控[15]。因此，本研究探讨FOXO4在肾癌中的表达是否也受miRNA调节。为此，本研究使用StarBase、miRDB、TargetScan和miRcode数据库预测FOXO4的潜在调控miRNA。这4个数据库预测的共同miRNA被认为是FOXO4表达调控的潜在miRNA。此外，StarBase数据库中的517个肾癌样本和71个正常对照样本也用于分析潜在miRNA的表达，以及使用517个肾癌样本分析FOXO4与其miRNA调节因子在肾癌中的表达相关性，根据miRNA表达的中位值将517个肾癌样本分为高表达组（258个样本）和低表达组（259个样本），分析预后关系。

1.9 双荧光素酶报告基因实验 1.8结果显示hsamiR-142-3p是调控FOXO4表达的miRNA。本研究进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证FOXO4与hsa-miR-142-3p的靶向调节作用关系。首先，应用StarBase数据库获得FOXO4与miR-142-3p的结合序列，在此基础上设计并合成野生型FOXO4-3'UTR和突变型FOXO4-3'UTR序列，将这两个片段克隆到pmir-GLO荧光素酶报告基因载体上，分别构建FOXO4野生型载体（FOXO4-WT）和FOXO4突变型载体（FOXO4-MUT）。接着，扩增重组载体，并用SanPrep去除内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒。随后，将HEK293T细胞接种于24孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。将FOXO4-WT和FOXO4-MUT质粒和miR-142-3p模拟物或miR-142-3p阴性对照通过Lipofectamine 2000（美国Thermo Fisher Scientific公司）分别共转染到293T细胞中。48 h后，通过双荧光素酶报告基因试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）检测荧光素酶的活性。

1.10 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0统计软件。计量资料两组间比较采用两独立样本t检验。在Kaplan-Meier plotter数据库中使用Kaplan-Meier法和log-rank检验进行预后分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌中FOXO4 mRNA和蛋白表达 通过Oncomine数据库发现，大多数肿瘤，包括肾癌中FOXO4 mRNA表达下调（图1a，见插页）。进一步分析FOXO4在不同肾癌数据集中的mRNA表达发现，与正常肾组织样本相比，肾癌样本中FOXO4 mRNA表达水平明显降低（均P＜0.01）（图1b，见插页）。随后，利用UALCAN平台中来自TCGA数据库的更多肾癌样本分析了FOXO4 mRNA表达水平，与上述结果一致，肾癌样本中FOXO4 mRNA表达水平亦明显低于正常肾组织样本（P＜0.01）（图2a）。此外，与正常肾组织样本相比，不同癌症分期和肿瘤分级亚组中FOXO4 mRNA表达水平均降低（均P＜0.01）；与Ⅰ期亚组相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期亚组中FOXO4 mRNA表达水平均降低，而其表达在任何两个肿瘤分级亚组中差异均有统计学意义（均P＜0.01）（图2b和c）。利用UALCAN平台比较了CPTAC数据库的肾癌样本与正常肾组织样本中FOXO4蛋白表达，结果显示，与正常肾组织样本相比，肾癌样本中FOXO4蛋白表达水平下降（P＜0.01）（图2d）。

图2 UALCAN数据库FOXO4在肾癌中的表达（a：肾癌样本与正常肾组织样本中FOXO4 mRNA表达箱线图；b：基于肿瘤分期的肾癌亚组中FOXO4 mRNA表达箱线图；c：基于肿瘤分级的肾癌亚组中FOXO4 mRNA表达箱线图；d：肾癌样本与正常肾组织样本中FOXO4蛋白表达箱线图）

2.2 FOXO4表达对肾癌细胞生存的影响 为研究FOXO4对肾癌细胞存活能力的影响，首先检测了FOXO4在两个肾癌细胞系中的表达。与肾癌组织结果一致，FOXO4在769-P和786-O细胞中的表达水平均低于人正常肾小管上皮细胞HK-2（图3a）。通过CRISPR/dCas9将FOXO4表达水平上调后（图3b），769-P和786-O细胞存活水平明显降低（图3c和d），表明FOXO4对肾癌细胞的生长起到抑制作用。

图3 FOXO4表达对肾癌细胞生存的影响（a：FOXO4在肾癌细胞中的表达情况；b：通过CRISPR/dCas9方法在肾癌细胞中成功过表达FOXO4；c：FOXO4过表达的769-P细胞存活明显降低；d：FOXO4过表达的786-O细胞存活明显降低）

2.3 FOXO4表达与肾癌不良预后的关系 Kaplan-Meier plotter在线数据库用于分析FOXO4表达与肾癌预后的关系，结果显示，FOXO4低表达组总生存率低于高表达组（P＜0.05）（图4），表明FOXO4在肾癌中具有预后预测价值，可以作为一个新的预后生物标志物。

图4 FOXO4在肾癌中的Kaplan-Meier生存曲线

2.4 FOXO4在肾癌中表达的miRNA调控因子的分析 通过整合4个在线数据库来预测FOXO4表达的miRNA调控因子，共获得715个miRNA。其中，hsamiR-142-3p是这4个数据库的共同miRNA（图5a）。分析StarBase数据库的肾癌样本及正常对照样本数据发现，与正常对照样本相比，肾癌样本中hsa-miR-142-3p表达明显上调（图 5b），hsa-miR-142-3p与FOXO4表达呈明显负相关（图5c），表明它们之间可能存在靶向调控关系。此外，本研究发现hsa-miR-142-3p高表达不利于肾癌的预后（图5d），这与FOXO4低表达的预后意义一致。

图5 肾癌中调节FOXO4表达的miRNA基因的预测和分析（a：FOXO4表达的预测miRNA调节因子的韦恩图；b：肾癌中hsamiR-142-3p表达的箱线图，**P＜0.01；c：肾癌中hsa-miR-142-3p与FOXO4的共表达分析；d：肾癌中hsa-miR-142-3p的Kaplan-Meier生存曲线）

2.5 Has-miR-142-3p与FOXO4在肾癌中具有靶向调控关系 基于目标基因序列，本研究构建了两种不同的FOXO4-3'UTR突变体（图6a）。双荧光素酶报告基因结果显示，在野生型FOXO4-3'UTR细胞中，荧光素酶活性相对降低，而FOXO4-3'UTR的两个突变型都抑制了荧光素酶活性的降低（图6b），表明FOXO4是hasmiR-142-3p在肾癌中调控的靶基因。

图6 FOXO4受has-miR-142-3p靶向调节（a：构建FOXO4-3'UTR突变型序列；b：FOXO4-3'UTR的两种突变体都阻滞了荧光素酶活性的降低，*P＜0.05，nsP＞0.05）

3 讨论

FOXO家族是FOX蛋白家族的一个亚家族，由FOXO1、FOXO3A、FOXO4和FOXO6 4个成员组成，这些成员参与着多种生理、病理过程，如细胞分化、存活和细胞代谢等[16-18]。在人类肿瘤发生、发展中，它们可以抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，因而被认为是肿瘤抑制因子[19]。以往研究表明，FOXO4表达在多种人类肿瘤类型中明显下调，与肿瘤的发生、侵袭、转移及患者预后密切相关[20]。本研究结果表明FOXO4表达亦在肾癌中显著降低，mRNA转录水平和蛋白水平，这与已报道的的研究结果一致[10]。在体外实验中，本研究发现肾癌细胞中FOXO4也低表达，而FOXO4高表达可降低肾癌细胞的存活能力，表明FOXO4在肾癌中发挥抑癌作用。此外，本研究发现FOXO4低表达与肿瘤分级和分期有关，FOXO4低表达与肾癌患者的不良预后有关，表明FOXO4在肾癌进展中发挥重要作用，也有望成为肾癌新的预后生物标志物。

机制上，先前的研究已表明FOXO4是miRNA促进肿瘤发生、发展的重要靶标[15，19]。例如，Wang等[21]揭示了miR-1274a可通过靶向FOXO4并抑制其表达而促进胃癌细胞的生长和迁移。Liu等[22]研究结果显示miR-499-5p可通过调节FOXO4表达而加速直肠癌细胞的侵袭和远处转移。相似的研究结果也在宫颈癌、肺癌、鼻咽癌、骨肉瘤、结肠癌等肿瘤中有报道[23-27]。然而，在各种肿瘤类型中调节FOXO4表达的miRNA是不同的，这表明FOXO4表达的miRNA调节因子具有肿瘤类型依赖性。值得注意的是，FOXO4在肾癌中表达的miRNA调节因子尚未有研究报道。因此，本研究试图探寻FOXO4在肾癌中表达的miRNA调节因子。结果显示，hsa-miR-142-3p是不同预测数据库中FOXO4的共同miRNA。肾癌中hsa-miR-42-3p表达水平上调并与FOXO4表达呈负相关，表明hsa-miR-142-3p与FOXO4具有靶向调节关系。随后，本研究通过双荧光素酶报告基因实验验证了它们的靶向关系。

Hsa-miR-142-3p是一个重要的调节因子，在包括癌症在内的多种疾病中发挥重要作用[28]。先前的研究已表明hsa-miR-142-3p在肾癌组织中显著上调并作为致癌基因发挥作用，下调hsa-miR-142-3表达可抑制肾癌细胞的生存、侵袭能力，以及诱导细胞凋亡[29]。然而，hsa-miR-142-3p在肾癌中的分子机制尚未被揭示。因此，本研究结果或可为hsa-miR-142-3p参与肾癌发生、发展的机制提供一定的证据和补充。

综上所述，FOXO4参与了肾癌的发生、发展，有望作为肾癌的潜在分子标志物和治疗靶点。此外，本研究结果也可能为探寻hsa-miR-142-3p在肾癌中发挥作用的机制提供重要线索。