还原型谷胱甘肽的特性、工业生产及在大健康行业的应用研究进展

蔡友华 吴子豪 黄晓辰,2 林钰宽 郑明英

(1. 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东 肇庆 526040；2. 肇庆学院食品与制药工程学院，广东 肇庆 526061)

还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是真核生物中最丰富的非RNA编码的含硫醇三肽，显著的抗氧化活性使其成为众多研究的焦点。随着科学技术的发展，GSH的潜在生理活性陆续被挖掘出来，包括整合解毒、延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等。随着对GSH活性功能研究的深入及消费者健康意识的增强，GSH的应用价值日益凸显，被广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品等大健康领域。文章对GSH的结构性质、生理活性、代谢途径、制备、提取纯化、应用及工业生产等的研究进展进行综述，旨在为谷胱甘肽的生产和开发应用提供科学依据。

1 还原型谷胱甘肽的概述

1.1 结构特征

GSH是一种水溶性三肽，由L-谷氨酸(L-Glu)、L-半胱氨酸(L-Cys)和甘氨酸(Gly)缩合而成[1]4(结构式如图1)。GSH的结构特性主要包括以下几方面：①L-谷氨酸的γ-羧基与L-半胱氨酸的α-氨基结合形成γ-肽键，可防止GSH被细胞内肽酶切割，也可防止被质膜上的γ-谷氨酰转肽酶水解；② GSH中的两个羧基、一个胺和一个硫醇，本质上是亲水的，使GSH成为一种极易溶于水的化合物；③L-半胱氨酸的游离巯基(—SH)是GSH中最重要的活性基团，可参与氧化还原反应及亲核置换反应。在机体内，90%以上的GSH以还原型形态存在。GSH可被谷胱甘肽过氧化物酶转化为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，随后，又可通过谷胱甘肽还原酶使其再次还原为GSH[2-3]。

图1 还原型谷胱甘肽(GSH)的化学结构式Figure 1 The chemical structure of reduced glutathione (GSH)

1.2 生理活性

作为哺乳动物细胞内最主要的非蛋白巯基和含量最丰富的低分子量多肽，GSH广泛分布于机体各器官内，直接或间接参与多种生理活动，维持细胞生物功能。主要功能包括：① 与GSSG组成细胞内重要的氧化还原对，维持氧化还原平衡[4-5]；② 作为细胞抗氧化系统中最重要的抗氧化剂之一，可以保护脂质、蛋白质、DNA、酶等生物大分子抵抗氧化应激损伤，保持活性[6]；③ 在谷胱甘肽-S-转移酶的作用下，通过亲核进攻—结合反应对重金属和外源性物质进行解毒；④ 通过“γ-谷氨酰循环”储存和运输半胱氨酸，是半胱氨酸的储存库；⑤ 调节细胞内信号转导，维持细胞正常生命活动[7]；⑥ 参与氨基酸的跨膜转运，促进白细胞的生成，发挥免疫增强作用[8]。现代研究[9]表明，各种与年龄相关的慢性疾病，例如与神经退行性疾病、线粒体功能障碍甚至癌症相关的疾病，都与GSH水平欠佳或缺乏有关。保持适宜的GSH/GSSG比率是细胞生存的关键，其中GSH的合成被认为是细胞抵抗氧化损伤和自由基产生的一种关键防御机制。

1.3 在生物体内的代谢途径

GSH存在于大多数原核和真核生物中，细胞内的GSH是以L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸为原料，在ATP存在的条件下，由细胞质中两种可溶性酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCL或GSHⅠ，EC 6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(GS或GSHⅡ，EC 6.3.2.3)的连续催化合成[1]5。该合成途径在生物体内最为普遍，几乎发生在所有类型细胞中，肝脏是GSH合成和输出的主要场所。GSH的胞内水平取决于两种合成酶的水平和活性、ATP的产生以及底物氨基酸(尤其是半胱氨酸)的含量。其中，GSHⅠ是GSH合成途径的限速酶，其活性会受到GSH反馈抑制调节[1]5。

在高等动植物细胞中，GSH通过γ-谷氨酰循环进行代谢(图2)。一部分GSH被组织细胞直接吸收进入细胞，有的则会被细胞膜上的γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)降解成氨基酸[10]。大多数动物的肝脏、肾、肺、小肠等器官中都有分解GSH的酶[11]。据报道[12]，酵母细胞中也存在不完整的γ-谷氨酰循环，所以可能存在相似的GSH代谢途径。此外，酿酒酵母的液泡中含有γ-GT酶，其存在可能导致发酵和下游加工过程中GSH的降解和损失。

2 还原型谷胱甘肽的工业生产

2.1 还原型谷胱甘肽的制备

2.1.1 溶剂萃取法 萃取法是GSH工业化生产早期的一种方法，主要通过萃取和沉淀等操作从动植物富含谷胱甘肽的组织，如植物种子胚芽、酵母、鸡血等提取谷胱甘肽[13]。萃取法生产谷胱甘肽方法成熟、操作简单、工艺要求低、污染少、产物纯度高，但由于动植物中GSH含量相对较低，导致生产所需原物料用量大、成本高，但产品产量低，不适用于工业化生产GSH。

2.1.2 化学合成法 GSH的化学合成法制备是将L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸脱水缩合形成三肽GSH的过程，主要经过基团保护、脱水缩合、脱保护3个步骤实现[14]。GSH的化学合成法在20世纪50年代就已经形成工业化，技术较为成熟，但这种方法反应操作复杂、工艺难度高、耗时长、污染大，而且得到的产物是左旋GSH(L-GSH)和右旋GSH(D-GSH)的混合物，纯度低，效价不稳定，所以化学合成法也早已被工业生产所淘汰。

2.1.3 酶合成法 酶合成法主要利用微生物体内的GSH合成所需的酶包括GSHⅠ和GSHⅡ，以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸为底物，并添加一定量的ATP、镁(辅酶因子)、磷酸盐缓冲液(pH稳定)和钙等合成GSH(图3)，可以避免形成外消旋体(DL-GSH，由等量的L-GSH和D-GSH混合而成，无旋光性)[14-16]。GSH合成所需的酶主要来自大肠杆菌或者酵母菌。GSHⅠ和GSHⅡ分别由原核生物中的gshA和gshB编码(真核生物中的gsh1和gsh2)。过表达GSHⅠ和GSHⅡ是提高GSH产量的有效途径。此外，为了重复利用酶，生产过程中一般采用细胞或酶固定化，不仅能提高GSH的生产效率，也方便生产过程的自动化控制。酶法合成的优势在于具有很高的特异性，生产工艺明确、操作简单、生产周期短，反应速度快，产品浓度高且较易纯化，但加入的前体物料氨基酸和ATP价格相对昂贵，成本较高[17]。近年来，学者们在利用酶法合成GSH方面进行了有益探索和实践(见表1)，主要包括：① 寻求高效的ATP生成系统，降低原料成本；② 发掘高性能的谷胱甘肽合成酶系统，缓解产物的反馈抑制，提高产量。然而，到目前为止，酶法合成GSH未实现工业化规模的转化，仍然是一个有待持续研究的方向。

图2 γ-谷氨酰循环Figure 2 The γ-glutamyl cycle

图3 酶法合成GSH途径及工艺流程Figure 3 The pathway and process flow of enzymatic synthesis of GSH

表1 酶法合成GSH的技术方法(2015—2022年)

2.1.4 生物发酵法 生物发酵法生产GSH是利用廉价的糖类原料，通过酵母或细菌自身的物质代谢合成GSH。其中，GSH合成酶活力、胞内能量供应及发酵培养基组分是影响GSH高效合成的重要因素。常见的发酵微生物包括酿酒酵母菌、毕赤酵母、产朊假丝酵母和大肠杆菌[23]。由于酵母中GSH含量较高，遗传背景清晰，所以常被用作生产GSH的首选菌种，特别是产朊假丝酵母和酿酒酵母[24-25]。拥有多项GSH生产专利的日本协和发酵生物株式会社(Kyowa Hakko Bio)自1970年便开始采用从面包酵母中提取谷胱甘肽的方法生产GSH。自然界中野生型微生物细胞中GSH的含量通常不高，一般是1～10 mmol/L，这导致GSH的实际生产成本非常高[26]。因此，通常采用诱变或者基因工程来提高GSH合成酶的活性，或通过优化发酵条件提高前体的利用率，或促进胞内GSH外排，减少胞内GSH合成的反馈抑制，从而提高GSH产量[27-29]。此外，利用大肠杆菌发酵产GSH也可获得较高的产量和浓度[30-32]。但值得注意的是，在使用革兰氏阴性菌时，必须大量消耗细胞膜中的脂多糖或内毒素，避免人体产生强烈的免疫反应[14]。近年来，利用不同微生物发酵提高GSH浓度的工艺研究见表2。整体而言，微生物发酵法生产GSH与较早的萃取法、化学合成法、酶合成法相比具有步骤简单、条件温和、成本低、效率高、速度快、易分离、污染少等优点，已经成为目前工业大规模生产GSH最常用的方法，其主要工艺流程见图4。

表2 不同微生物发酵提高GSH浓度的工艺途径(2015—2022年)

续表2

图4 发酵法制备GSH的工艺流程Figure 4 The process of preparing GSH by fermentation

2.2 还原型谷胱甘肽的提取纯化

2.2.1 提取方法 发酵法是生产GSH的主要方法，由于GSH是胞内产物，需对菌体细胞进行破壁提取释放GSH。抽提方法包括物理法、溶剂法和热水抽提法。物理抽提法是结合高温加热、低温冻融、机械研磨、高压均质等处理，破坏酵母细胞壁，加速GSH溶出[52-53]；化学法是利用甲醇、甲酸、乙醇、对羟基苯甲酸丙酯等溶剂进行抽提[54-56]。与前两种破壁提取方法不同的是，热水抽提法利用了GSH分子量小且水溶性好的特性，可在不完全破壁的情况下高效提取细胞内的GSH，结合适宜的pH，可提高提取效率，减少样品的氧化损失，且能有效降低样品中大分子肽的含量，减少膜过滤等设备的损耗。较其他方法提取效率高(提取率90%以上)、耗时短、成本低、无污染，且对设备要求低、易于放大，适合工业生产推广[57][58] 9。

2.2.2 纯化方法 GSH的细胞提取液含大量性质与GSH相近的杂质氨基酸和肽，需进一步分离纯化才能得到高纯度的GSH成品。铜盐法是最早用于GSH纯化的方法之一，其技术门槛较低，但是该方法工艺步骤比较繁琐，而且GSH的收率低、环境污染大，目前在工业生产中已逐步被淘汰[59]。双水相萃取法是利用GSH在双水相中的分配不同，使其与发酵液中杂质分离，操作步骤少、提取效率高、能耗低、易于规模化，但系统成本昂贵，目前尚未在工业生产中推广应用[60]。

离子交换树脂法是氨基酸和蛋白质分离纯化的常用方法[61-62]，对于GSH的纯化主要使用的是阳离子交换树脂，且上柱前需经超滤除去大分子蛋白杂质。目前，用于GSH分离纯化的阳离子交换树脂多为强酸型，可防止GSH在高pH条件下被氧化成GSSG[60]。此外，除了优异的吸附性能，强酸型阳离子交换树脂还兼具分子筛功能，对溶液中大分子杂质具有过滤除杂和脱色效果。经阳离子树脂吸附后的GSH还需洗脱除杂，再经浓缩干燥得到成品。离子交换树脂法因技术相对成熟，而且经济效益高，适于工业化生产。此外，Wang等[63]提出的超滤—纳滤一体化工艺也是一种从酵母提取物中浓缩纯化谷胱甘肽的有效方法，具有较好的应用前景。

3 还原型谷胱甘肽在大健康领域中的应用

当前，美国、欧洲、中国和日本是GSH消费的主要国家和地区。GSH在欧洲、北美、东南亚市场的应用较为成熟，主要集中在化妆品和保健品领域。在欧洲，以抗氧化、提高免疫力、保肝和排毒美白等功效的化妆品、个人护理及保健品行业的崛起大力拓展了GSH的应用[64-65]。中国的GSH市场处于起步阶段，目前主要集中在医药领域，相关的GSH产品在临床上已经被广泛应用，可作为解毒剂、抗氧化剂、抗过敏剂等，是肝脏疾病的主要治疗药物和多种疾病的辅助治疗药物。随着国民收入的增长以及健康意识的提高，对营养保健品的需求不断增强，将促进GSH行业的持续增长。

3.1 在医药领域的应用

GSH的失衡与多种疾病有关，例如糖尿病、神经退行性疾病、艾滋病、癌症或衰老，这些疾病的发生主要是基于细胞水平上的氧化应激保护受到干扰[66-68]。因此，GSH可以作为一种生物标志物来检测疾病，也可以用作特定治疗的潜在药物或药物前体[69]。

在制药工业中，已实现临床应用的GSH药品包括GSH注射剂、片剂和滴眼液等，主要适用于：① 酒精及药物中毒等的辅助治疗；② 酒精、病毒、药物及其他化学物质导致的肝损伤的辅助治疗；③ 电离射线所致治疗性损伤的辅助治疗；④ 低氧血症的辅助治疗；⑤ 角膜溃疡、角膜上皮剥离、角膜炎、初期老年性白内障等的辅助治疗[70]。其中，注射和口服剂型主要有中国的阿拓莫兰、双益健、松泰斯、绿汀诺等品牌及国外的泰特、古拉定等，滴眼液主要有依士安和天亿等品牌。另外，强生、辉瑞、罗氏、默沙东等大型制药商对药物原料的需求很高，GSH在组织修复和构建、免疫系统增强、哮喘、贫血、抗肿瘤等诸多药物中的广泛和高度应用将促进其在制药行业的进一步增长。

除了药剂之外，GSH作为皮肤增白剂在医美领域的用途也非常突出，能够清除自由基、抗氧化、美白肌肤、淡化色斑，还有抗衰老的功效[58]7。作为医美原料，是美白针、部分美白护肤品和口服美白保健品的主要成分[2]。

3.2 在食品领域的应用

在食品领域，GSH强大的抗氧化性能也备受关注，一方面可被应用于乳制品、肉类、婴儿食品、调味料等的加工，发挥抗氧化、抑制褐变、延长保藏期、增强风味等作用；另一方面，作为功能活性因子，用于功能性食品和口服保健品的生产[71]。

将GSH添加到乳制品中可有效地防止乳制品的褐变，且能增强乳制品的风味和营养价值[72]。在果蔬类食品中添加GSH，同样可以防止褐变从而保持果蔬原有的色泽品质[73]。面制品中的GSH含量通常较低，在加工过程中适量添加GSH可以提升营养价值，有效抑制面制品的褐变，保持较好的色泽。在面包制作过程中添加GSH可以阻止小麦面团蛋白质网络中二硫键的生成，使面团保持松软，改善烘焙特性[74]。在畜禽肉和水产品加工过程中添加GSH可有效抑制核酸分解，改善品质，增强风味，延长货架期[75]。在酿酒过程中，GSH可以捕获葡萄汁氧化过程中形成的邻醌，控制氧化劣变引起的不良色泽，保持果酒的特征香气[76]。此外，作为厚味肽γ-谷氨酰肽的典型代表，GSH能赋予食品浓厚饱满、绵延持久的味感，强化呈味效果，是一种功能型调味剂，可将GSH或富含GSH的酵母细胞用于改善食品的风味品质[77]。

随着生活水平的日渐提高和健康意识的增强，人们的注意力从疾病治疗逐渐转移到疾病预防、增强体质和延年益寿等方面[78-79]。GSH可以清除体内多种自由基，且能参与生物转化，促进机体内有害物质排出，还可帮助维持正常的免疫功能，具有抗氧化、解毒、延缓衰老、抗疲劳、缓解宿醉等作用，已被作为功能活性因子广泛应用于各类保健品。在北美、欧洲、东南亚、澳洲及韩国等发达国家，以GSH作为生物活性强化剂开发的系列功能性保健食品在市场上大受欢迎。在众多品牌中，美国普丽普莱(Puritan's Pride)、健安喜(GNC)、君可为(Drinkwel)、新加坡利维喜(LAC)等企业的GSH系列保健品占据市场的主导地位。中国的GSH龙头企业金城医药也先后取得了GSH保健品批文(谷胱甘肽葡萄籽维生素CE片)和GSH茶多酚片获得保健食品注册证书。

4 还原型谷胱甘肽行业现状

GSH应用范围广，在大健康产业背景下，随着生产技术日渐完善，产品应用需求持续攀升，GSH行业得以快速发展。2020年全球谷胱甘肽市场规模超过1.95亿美元，由于其在医药、化妆品、食品和保健品等众多行业的广泛应用，预计到2027年的复合年增长率将超过7%[80]。目前，GSH的市场价格约为5 000～8 000元/kg，全球供应商主要集中在日本和中国，主要生产商有日本的协和发酵生物株式会社(Kyowa Hakko Bio)和三菱集团旗下的兴人生命科学(KOHJIN Life Sciences)；中国的山东金诚生物制药、深圳古特新生生物科技等。其中，Kyowa Hakko Bio和山东金城是全球领先的GSH生产商。以美国市场为例(见图5)，近3年来其GSH年进口量达350 t，主要进口自中国、日本、新加坡、韩国和泰国[81]。在癌症发病率持续上升、新冠肺炎疫情常态化、环境污染严重等因素的综合影响下，消费者对增强免疫力、对抗环境中的各种污染物、抗衰老等方面的诉求愈加强烈，强力推动着GSH行业的发展。

图5 美国市场GSH年进口量(2019—2021年)Figure 5 Annual import volume of GSH in US market (2019—2021)

Kyowa Hakko Bio是GSH生产的世界领先者，其利用发酵法生产的GSH安全且纯度高(可达99.0%～101.0%)，可用作医药原料药、生物技术、化妆品和膳食补充剂。2019年该公司在印度尼西亚推出的Setria glutathione具有全球影响力。KOHJIN Life Sciences生产的GSH是目前全球唯一使用食用圆酵母(产朊假丝酵母，非转基因)生产的天然型高浓度GSH(>98%)，被FDA认定为GRAS(一般认为安全)。山东金城医药集团股份有限公司是全球市场谷胱甘肽原料的两大供应商之一，该公司与日本钟化株式会社合作，利用液糖和酵母粉作为主要原料，采用日本钟化株式会社提供的谷胱甘肽菌种发酵生产GSH。2020年公司的谷胱甘肽产量达500 t，全球市场占有率超过80%。尽管如此，由于生产菌种需要从日本钟化株式会社引进，且需不断更新，这就使得山东金城医药集团股份有限公司GSH的生产核心技术依赖于日本钟化株式会社，意味着中国GSH生产方面仍然缺乏完全自主的核心技术。深圳市古特新生生物科技有限公司则是采用分子生物学和合成生物学，利用酶法催化生产GSH。

5 总结与展望

还原型谷胱甘肽是机体重要的抗氧化剂、免疫增强剂和解毒剂，与细胞信号转导、氨基酸转运、酶活性、氮和硫代谢等息息相关，具有良好的应用潜力及前景。还原型谷胱甘肽工业化生产相关技术的研究一直是行业的研究热点，利用酵母菌进行分批补料发酵仍然是工业生产还原型谷胱甘肽的常用方法。作为有效的功能因子和活性成分，还原型谷胱甘肽在食品、保健品和医药领域已有广泛的应用。与此同时，在农业生产中，还原型谷胱甘肽作为生物肥和饲料添加剂，在植物种植、动物保健等领域的商业应用刚刚起步，将在农作物的增产增收和品质提升，以及动物增强免疫、促进生长、改善肉类品质等方面发挥重要作用[82-83]。随着对还原型谷胱甘肽研究的深入及其活性功能的挖掘，还原型谷胱甘肽的应用面将不断拓宽。但目前针对还原型谷胱甘肽的功能研究、工业生产及产品应用等方面仍存在不足之处，有待持续深入研究。

功能活性方面，还原型谷胱甘肽水平是反映疾病风险和健康状况的重要生物标志物，但其与膳食营养干预和相关疾病进展之间的作用机制仍不明确，针对特定疾病的最佳剂量、递送形式、代谢规律等仍有待更为深入的研究和探讨。

工业生产方面，尽管还原型谷胱甘肽制备技术上的突破使其工业产量有了巨大提升，但依然满足不了当前及未来市场的需求。因此，一方面需加快挖掘和培育特性优良的菌株，定向调控发酵过程中还原型谷胱甘肽高产、高纯、高效、高活性产出；另一方面，在下游的纯化和干燥过程中需保证还原型谷胱甘肽的活性，减少其降解和氧化，从而在降低生产成本的同时，进一步提升还原型谷胱甘肽的产量和质量，促进还原型谷胱甘肽产业的高质量跨越式发展。

产品应用方面，面对消费需求的多元化、个性化和便利化，在产品设计时不仅要关注剂型对制剂稳定性和还原型谷胱甘肽的释放、吸收及生物利用度的影响，还应充分考虑到适宜人群、服用习惯、应用场景等，确保产品的疗效和功能最大化。