非洲菊CAT2基因的克隆及表达

卢珍红, 武 欢, 焦元辰, 张永艳, 李绅崇, 杨春梅, 程春振

(1.云南省农业科学院花卉研究所，云南 昆明 650100；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；3.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；4.山西农业大学园艺学院，山西 晋中 030801)

过氧化氢酶(catalase, CAT)又称触酶，可将组织中过多的H2O2歧化为H2O和O2，减少过氧化导致的细胞损伤[1].CAT与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸酶(APX)一起被称为抗氧化酶保护系统.在植物中，抗氧化酶共同作用以维持氧化还原稳态[2].根据基因结构和序列特征，CAT可分为典型性CAT(单功能CAT)、非典型性CAT(锰CAT)和CAT-POD(双功能CAT)3种类型[3].根据卟啉结构所含金属离子的不同，又可分为铁卟啉酶(包括典型性CAT、CAT-POD)和锰CAT(非典型性CAT，含有锰离子活性位点)两类[4-5].此外，Willekens et al[6]基于烟草CAT基因的表达特征将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类.其中，Ⅰ类CAT在光合组织中强烈表达；Ⅱ类CAT在维管组织中表达最高；Ⅲ类CAT在种子和幼苗中显著表达.

植物CAT主要位于过氧化物酶体、乙醛酸酶体和细胞质中.它通常由一个小基因家族编码[7-8]，拟南芥[9]和烟草[10]均含有3个CAT基因成员，玉米有2个CAT基因成员[11]，棉花有7个CAT基因成员[12].CAT在植物防御应激反应、细胞氧化还原平衡和延缓衰老等方面发挥着重要作用，其表达具有一定的时空特异性[13-15].此外，众多研究表明，CAT基因在植物响应逆境胁迫，如盐胁迫[16]、干旱胁迫[17-18]、低温胁迫[8,16]及抗病[19-21]等过程中发挥着重要作用.

非洲菊(Gerberajamesonii)是世界五大鲜切花之一，同时也是研究复杂花序发育与进化的模式植物[22].在盐胁迫、干旱和寒冷等逆境下，非洲菊的生长及产量会受到严重抑制[23].根腐病是非洲菊的主要病害，可由隐地疫霉单独引起[24]，现已成为制约非洲菊产业健康发展的重大难题.鉴于CAT基因在植物抗逆防御过程中的重要作用，本研究基于转录组数据克隆了一个非洲菊CAT基因，分析了其核苷酸和编码蛋白序列特征，并检测其在盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫处理以及接种根腐病病菌隐地疫霉后的表达水平，旨在为揭示该基因的功能及其在非洲菊抗逆育种中的应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料处理

试验材料‘玲珑’非洲菊由云南省农业科学院花卉研究所提供.选取生长状态良好的盛花期植株的花茎、花蕾、叶柄和叶片用于总RNA的提取.选取生长状态良好、株高约为10 cm的幼苗进行逆境处理.其中，盐胁迫(200 mmol·L-1NaCl)、聚乙二醇(polyethylene glycol， PEG)模拟干旱胁迫(30% PEG)和4 ℃低温处理参照武欢等[25]和王星淇等[26]的方法，于处理0、4、8、12、24 h取叶；隐地疫霉接种参照郝向阳等[27]的方法，于处理0、2、4、6 d取根.所有样品均设置3次生物学重复，取样后立即置于液氮中速冻，之后置于冰箱(-80 ℃)中保存备用.

1.2 RNA提取及cDNA合成

利用Trizol RNA提取试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]提取非洲菊总RNA.采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]以oligo(dT)18作为反转录引物进行反转录合成cDNA第一链，用于基因全长克隆.qRT-PCR检测所用不同处理的样品cDNA使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removel)试剂盒(全式金生物技术有限公司)以oligo(dT)18和随机引物作为反转录引物合成.

1.3 CAT基因克隆及测序验证

从非洲菊转录组数据中筛选获得了一条具有完整开放阅读框(ORF)的CAT基因序列(GenBank登录号：MH708533)[28]，设计基因特异性引物(上游引物：TACATCAAGATCATGGAT；下游引物：TTCAATAGTTGGGGCGCAC)用于基因全长克隆.PCR反应体系(25 μL)包括12.5 μL Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2×)、9.5 μL ddH2O、1 μL cDNA、上下游引物各1 μL.PCR 扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34个循环；最后于72 ℃延伸10 min.所得PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后采用Gel/PCR Extraction Kit试剂盒回收目的片段，连接PMD18-T载体后转化DH5α感受态，选取菌液PCR鉴定为阳性的克隆子送至福州铂尚生物科技有限公司进行测序验证.

1.4 生物信息学分析

参照郝向阳等[24]的方法，利用在线软件分析非洲菊CAT2蛋白的基本理化性质、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点和保守结构域.利用在线工具PSIPERD(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)分别对蛋白的二级结构和三级结构进行分析.从NCBI数据库中检索并下载其他物种CAT的氨基酸序列，使用MEGA-X中的ClustalW程序进行多序列比对.采用最大似然法(ML)构建系统进化树.选择LG模式，执行参数为完全删除和1 000次重复.

1.5 非洲菊CAT基因表达水平的qRT-PCR检测

以非洲菊18S rRNA为内参基因进行qRT-PCR检测.以稀释5倍的cDNA为模板，采用Roche Lighcycler 480荧光定量PCR仪进行相对表达水平的检测.qRT-PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50个循环.qRT-PCR反应体系：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM荧光染料[宝日医生物技术(北京)有限公司]、7.4 μL ddH2O、上下游引物(上游引物:CATTCTGGCTTGACGACA；下游引物:TGGCGTGGCTGTGATTAG)各0.8 μL、1 μL模板.使用2-ΔΔCT法计算CAT2基因在不同处理下的相对表达量.利用SPSS软件分析不同样品在1%水平上的差异显著性，并使用GraphPad Prism 8.0.2软件作图.

2 结果与分析

2.1 CAT基因的克隆及序列

M：DL5000 marker.图1 扩增产物电泳检测图谱Fig.1 Electrophoresis gel of amplified products

成功地从“玲珑”非洲菊中克隆获得了一条1 490 bp的基因序列(图1).序列分析显示，该基因编码序列(coding sequence， CDS)的长度为1 479 bp，预测可编码492个氨基酸.Blastn比对结果显示，该基因与刺苞菜蓟(Cynaracardunculus)CAT2基因(XM_025133682.1)的相似度最高，为88.00%，故将其命名为GjCAT2.

2.2 GjCAT2编码蛋白的基本理化性质

蛋白理化性质分析显示，GjCAT2编码蛋白的分子质量为56.854 ku，分子式为C2558H3874N714O734S15，原子总数为7 895，等电点为6.5，脂肪系数为71.73，为稳定亲水蛋白.该蛋白由20种氨基酸组成，以天冬氨酸占比最高，约占7.3%，含有61个带正电荷残基(精氨酸+赖氨酸)和56个带负电荷残基(天冬氨酸+谷氨酸).蛋白保守结构域预测(图2)显示，该蛋白含有典型的CAT保守结构域PLN02609(位于第6～492位)和7个血红素结合位点(65H、104S、138N、143F、151F、344R、348Y)[3]，说明其属于过氧化物酶超家族和KatE超家族[30-31].二级结构预测(图3A)显示，该蛋白由26.02% α-螺旋、10.98% β-折叠、43.90%不规则卷曲和19.11%延伸链组成.该蛋白无跨膜结构及信号肽，推测属于非分泌性蛋白.磷酸化位点预测显示，该蛋白仅有4个磷酸化位点：位于第18位的酪氨酸，第7位的苏氨酸，第19、23位的丝氨酸.亚细胞定位预测显示，该蛋白主要定位于过氧化物酶体.保守序列分析显示，该蛋白具有CAT活性基序(CAM, FHRERIPERIVHARGAS)和CAT血红素结合位点(HBS, RVFAYGDAQ)[29].三级结构预测(图3B)显示，该蛋白含有4个亚基，由此进一步推测GjCAT2为典型性CAT[4].

图2 GjCAT2保守结构域预测结果Fig.2 Predicted conserved domain of GjCAT2

A：二级结构；B:三级结构.图3 GjCAT2二级结构和三级结构预测结果Fig.3 Predicted secondary and tertiary structures of GjCAT2

2.3 蛋白序列比对及聚类分析

蛋白序列比对(图4)显示：GjCAT2与刺苞菜蓟CAT的同源相似性最高，达96.95%；与向日葵、薇甘菊CAT的同源相似性分别为95.93%和94.11%.系统进化树共分为两个分支：GjCAT2与莴苣、刺苞菜蓟、向日葵等菊科植物CAT聚在一支，其他物种CAT聚在另一支(图5).

红线标识为CAT活性基序(CAM)和血红素结合位点(HBC).图4 不同植物CAT 蛋白序列多重比对结果Fig.4 Multiple alignment of CAT protein sequences from different plants

2.4 GjCAT2基因在非洲菊不同组织器官中及在不同非生物逆境处理下的表达水平

图6显示，GjCAT2基因在非洲菊正常健康植株不同组织器官中的表达水平存在显著差异.GjCAT2基因在花茎中的相对表达量最高，叶柄次之，叶最低；在花茎中的相对表达量显著高于叶、叶柄和花蕾，分别是叶、叶柄和花蕾的31.82、7.48和10.75倍.

图5 不同植物CAT系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of CAT proteins from different plants

图7a显示，盐胁迫处理下，GjCAT2基因的表达量呈“降—升—降—升”的趋势.GjCAT2基因在处理4 h的表达受到极显著抑制；处理8 h的相对表达量骤升达到峰值，为CK的3.48倍；随后于处理12 h急剧下降至与CK相近；处理24 h再次升高，相对表达量约为CK的2.66倍.

图7b显示，PEG模拟干旱处理后，GjCAT2基因的表达量呈“升—降—升”的趋势.GjCAT2基因在处理4 h的表达受到诱导；之后显著下降，并于处理12 h降到最低，相对表达量仅为CK的33.12%；处理24 h的相对表达量回升，与CK基本持平.

图7c显示，4 ℃低温处理下，GjCAT2基因的表达在胁迫前期受到显著诱导，处理8 h的相对表达量达到峰值，为CK的2.31倍；处理12 h的相对表达量仅为CK的18.00%；而处理24 h的相对表达量又恢复至与CK相近.

图7d显示，接种隐地疫霉后，GjCAT2基因的表达在处理2和4 d均受到极显著抑制，但处理6 d的相对表达量骤升为CK的3.11倍.

a：盐胁迫处理；b：PEG模拟干旱处理；c：4 ℃低温处理；d：隐地疫霉接种处理.图柱上附不同字母表示差异极显著(P<0.01).图7 不同胁迫处理对GjCAT2基因表达水平的影响Fig.7 Effect of different stress treatments on relative expression of GjCAT2 gene

3 讨论

本研究成功地从‘玲珑’非洲菊克隆获得了一个CAT基因(GjCAT2)，该基因序列与刺苞菜蓟CAT2基因的相似度高达88.00%.其编码蛋白预测定位于过氧化物酶体，具有典型性CAT2保守结构域和血红素结合位点，且属于KatE超家族，推测该蛋白为典型性CAT.此外，根据GjCAT2基因在非洲菊不同组织器官中的表达水平(花茎>叶柄>花蕾>叶)，推测GjCAT2属于Ⅱ类CAT.

多数CAT基因具有明显的时空特异性.辣椒CAT基因在茎中的表达水平显著高于叶和根，且在果实发育早期比成熟期更为丰富[20]；黄瓜CAT2基因则在茎、叶、花和果实中表现出更高的转录水平[13]；烟草CAT2基因在花中的表达量最高[27]；而水稻CATA基因和棉花CAT1～CAT4基因在所有发育阶段都表现出较高的表达水平[12,32].本研究结果表明，GjCAT2基因在非洲菊花茎中的表达量极显著高于其他组织器官，说明其具有Ⅱ类CAT基因的典型表达模式，在维管组织中的表达量较高.

CAT是一种重要的活性氧清除酶，在植物生长、发育和非生物胁迫响应中起着至关重要的作用[33-34].在盐胁迫条件下，油菜CAT基因家族成员和黄瓜CAT基因均有不同程度的上调表达[35-36]；甘薯在200 mmol·L-1NaCl处理2和11 d时，幼叶中CAT2基因的表达量分别比CK上调了72.74和352.48倍，在膨胀块根中的表达量同样在处理11 d时达到最大值[14].本研究结果表明，GjCAT2基因在NaCl处理4 h时，其表达受到极显著抑制，而在处理8和24 h时的相对表达量又出现了不同程度的上升，分别为CK的3.48和2.66倍，说明GjCAT2基因在盐胁迫下被两次诱导，进而在非洲菊抗盐反应中发挥作用.

研究表明：水稻CATA和CATC基因的过表达是通过被耐盐受体样细胞质激酶磷酸化和激活，进而提高了转基因水稻的耐旱性[37]；甘蔗CAT1基因在25% PEG处理下被显著诱导[38].本研究结果表明，GjCAT2基因的表达在PEG模拟干旱胁迫初期受到显著诱导，其表达水平于处理8 h时达到峰值，处理12 h时骤然下降，但处理24 h时又出现回升，表明GjCAT2基因在非洲菊早期抵御干旱过程中发挥的作用更大.

大量研究表明，CAT基因的表达丰度可在胁迫开始时显著上调[8,39-40].13 ℃低温处理下，水稻CAT活性显著提高，CATB基因的表达受到显著诱导，CAT活性与CATB基因的表达呈正相关[41].本研究中，GjCAT2基因的表达受4 ℃低温胁迫诱导显著，其相对表达量于处理8 h时达到峰值，为CK的2.31倍，暗示着GjCAT2基因参与非洲菊早期低温应答.

CAT在植物抗病过程中也发挥着重要作用.棉花在受大丽花弧菌感染后，CAT基因家族均受显著诱导[12]；烟草在接种烟草病原菌后，瞬时过表达CAT2基因的叶片表现出较轻的病状[19]；而拟南芥CAT2敲除突变体中含更多的H2O2，表明CAT2是清除活性氧的关键酶之一.本研究中，接种隐地疫霉早期(2、4 d)，GjCAT2基因的表达受到极显著抑制，处理6 d的相对表达量显著升高，为CK的3.11倍.GjCAT2基因的表达在感病前期被显著抑制可能与病原菌侵染有关，表达量在接种隐地疫霉6 d后才开始上调，说明此时非洲菊根系已经受到显著的氧化胁迫.GjCAT2基因表达量的增加有助于清除由病原菌刺激产生的H2O2，在抵御根腐病过程中发挥着重要作用.

4 结论

本研究成功地从‘玲珑’非洲菊克隆获得了一个CDS长度为1 479 bp的GjCAT2基因，其编码蛋白具有典型性CAT保守结构域和血红素结合位点，是属于KatE超家族的典型性CAT.根据GjCAT2基因在花茎中高水平的表达特征，推测其属于Ⅱ类CAT基因.此外，GjCAT2基因的表达受盐胁迫、干旱、低温和隐地疫霉的影响显著，推测其可能在非洲菊抵御这些逆境中扮演着重要角色.