五株大豆疫霉鉴定及其致病力差异机制初步研究

刘 冬，胡九龙，李坤缘，李 萍，刘 枭，高智谋*

(1.安庆职业技术学院农林与服装学院，安徽安庆 246003；2.安徽农业大学植物保护学院，安徽合肥 230036)

0 引言

大豆疫霉是大豆上的毁灭性病害，该病害为土传病害较难防治；目前由大豆疫霉引起的大豆疫病在我国多个省份均有报道，如黑龙江省、安徽省和福建省[1].大豆疫霉的侵染导致大豆大幅减产，给粮食安全造成较大的威胁并成为研究热点[2].研究人员在大豆疫霉与大豆互作及其有效防治等方面做了较多的研究工作[3-6].南京农业大学团队在大豆疫霉与大豆的互作研究中做出了重要贡献，他们以转录组和蛋白组等组学技术挖掘了大量的可能参与大豆疫霉侵染的致病基因以及可能抑制大豆防卫反应的效应分子[7-8].该团队进一步通过基因沉默技术和基因编辑技术证实了一些基因如PsYKT6等会通过影响疫霉生长速率、产生孢子囊的数量和游动孢子的释放等调控大豆疫霉的侵染尽而影响致病力[8].另外，通过pull-down和酵母双杂技术鉴定出可能与大豆互作的一些蛋白，这些蛋白主要属于RXLR家族[9].在350多个RXLR效应分子中约75%的会抑制蛋白Bax引起的植物防卫反应，如Avh331抑制MAPK介导的植物防卫反应协助大豆疫霉的侵染活动[10].作为土传病害大豆疫病的有效防治挑战巨大，加之我国正在推进《到2020年农药使用量零增长行动方案》，大豆疫霉的绿色防控成为研究热点之一.研究人员从植物中提取有效成分，如精油、多酚和酸物类质用于疫霉引起病害的防治[11-13].野菊花精油对烟草疫霉引起的病害具有良好的防治效果[11].Liu等人[12]发现抗氧化剂没食子酸丙酯可以通过干扰脂肪酸代谢途径抑制大豆疫霉的生长和侵染，其抑制率为50%的浓度(EC50)为97.2 mg/L.Piotrowski等人[13]从禾本科植物分离到“poacic acid”可以通过阻碍大豆疫霉细胞壁的形成抑制大豆疫霉，其EC50值为111 mg/L.本研究从大豆根茎及土壤中分离了5株病原真菌，根据形态学和分子生物学技术对其鉴定，并初步探索了它们致病力存在差异的机制.

1 材料和方法

1.1 验材料与仪器

主要试验材料有V8果汁(深圳市欧美汇贸易有限公司)、氨苄青霉素(Thermo Scientific)、利福平(Thermo Scientific)、2× Taq Plus PCR MasterMix (TAKARA)等.大肠杆菌感受态细胞、引物及测序服务均有南京擎科生物科技有限公司提供.大豆疫霉模式菌株p6497由南京农业大学王源超教授馈赠.试验主要仪器包括生物安全柜(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)、正置荧光显微镜(Nikon)、PCR仪(Bio-Rad Lab)、凝胶成像系统(Bio-Rad Lab)、超微量核酸蛋白分析仪(美国宝腾)等.

1.2 试验方法

1.2.1 大豆疫霉分离与培养 大豆疫霉菌的分离与培养参考郑小波教授编著的《疫霉菌及其研究技术》[14]完成，并将分离的5株菌编为BZ1、BB8、FY8、SZ2和BZ9.在10%V8培养基中加入50 μg/mL氨苄青霉素和20 μg/mL利福平提高分离效率.

1.2.2 大豆疫霉形态观察 将分离的大豆疫霉分别接种到10%的固体和液体V8培养基上，观察固体培养基上的大豆疫霉菌落形态并测量大豆疫霉的生长速率[15]，即用游标卡尺测定培养5天的大豆疫霉菌落直径，生长速率为菌落直径与培养天数的比值.利用软件SPSS20.0对大豆疫霉菌株生长速率差异情况进行单因素方差分析，其差异性(P<0.05)用最小显著性差异检验进行判定.参考《疫霉菌及其研究技术》[14]在光照下用无菌水诱导孢子囊形成，低温游动孢子释放在诱导的培养皿加入大豆根；在显微镜下观察菌丝形态，卵孢子、孢子囊和游动孢子的侵染情况.

1.2.3 PCR扩增、DNA片段测序及构建系统发育树 根据LIU等人[1]的报道以特异性引物ITS6和ITS8参考其PCR条件进行PCR扩增；胶回收DNA片段链接T载体转化到感受态大肠杆菌中，摇菌24 h测序.测序结果与GenBank数据库的数据BLAST 比对，用软件MEGA5.0构建系统发育树[16].

1.2.4 大豆疫霉致病力测定 取大豆疫霉菌碟接种到大豆叶片上保湿2～3 d.以病斑直径和相对生物量为指标，利用WANG等人[17]报道的方法评价大豆疫霉的致病力差异.以体积比3∶1混合乙醇和冰醋酸，加热对大豆叶片脱色，褐色部分为大豆疫霉侵染造成的病斑，用游标卡尺测定病斑直径.以qRT-PCR检测被侵染大豆叶片中大豆疫霉管家基因(Physo1_1108986)和大豆管家基因(EFla)的表达量，它们的比值为相对生物量并用于评价大豆疫霉致病力的强弱.用软件SPSS20.0对大豆疫霉菌株致病力差异情况进行单因素方差分析，其差异性(P<0.05)用最小显著性差异检验进行判定.

1.2.5 qPCR法测定致病基因的表达 提取RNA反转录成cDNA，并根据文献报道的qPCR引物和条件进行致病基因的表达量的测定[18-22]；qRT-PCR体系为25 μL，主要反应程序为 95 ℃30 s，39 个循环 (95 ℃5 s, 60 ℃30 s)[5].以上定量试验重复3次，设3个技术平行.

2 结果与分析

2.1 大豆疫霉的形态特征

5株大豆疫霉在10%V8培养基上能较好的生长，菌落呈现白色绒毛状松散，它们的菌落形态与大豆疫霉模式菌株P6497相近(图1).5株大豆疫霉形态特征基本一致，如图2所示菌丝较直向外延伸生长，菌丝无隔膜顶端呈椭圆状均能产生孢子囊和卵孢子，孢子囊低温诱导释放游动孢子，它们趋向性侵染大豆根部.

图1 大豆疫霉菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Phytophthora sojae图2 大豆疫霉形态特征Fig.2 Morphology characteristics of Phytophthora sojae

2.2 引物ITS6和 ITS8扩增结果及系统发育树

用特异性引物ITS6和 ITS8进行PCR扩增大豆疫霉基因组DNA的保守序列区域，获得大小为288bp的DNA片段.经测序比对与大豆疫霉菌株MT367711.1、MT367710.1、MT367709.1和MT355402.1的保守序列同源性为100%(图3)；结合形态学鉴定为大豆疫霉[14].

图3 五株大豆疫霉的系统发育树Fig.3 Phylogenetic trees of five strains of Phytophthora sojae

2.3 五株大豆疫霉生长速率比较

如图4所示5株大豆疫霉生长速率存在差异，大豆疫霉FY8的生长速率与模式菌株P6497基本一致，而菌株BB8和BZ1的生长速率显著大于它们，生长速率大于12 mm/d.不同的是与模式菌株P6497相比，SZ2和BZ9的生长速率显著较慢，其生长速率分别为7.2 mm/d和6.1 mm/d.

2.4 五株大豆疫霉致病力分析

如图5A所示5株大豆疫霉生在大豆叶片上造成的病斑大小明显不同，即表明它们的致病力存在差异.与模式菌株P6497的致病力相比(图5B)，可将它们的致病力划分为“强”、“中”和“弱”三个等级，菌株BB8和BZ1的致病力显著(p<0.01)高于菌株P6497，FY8的致病力与其相当，而菌株SZ2和BZ9的致病力较弱显著低于(p<0.01)模式菌株P6497.这一现象可能与它们的生长速率相关，在有关文献报道中也出现类似的现象.另外，大豆疫霉和被侵染大豆叶片的相对生物量结果(图5C)进一步证实了上述推测；即生长速率较快的大豆疫霉在被侵染的大豆叶片中相对生物量高，造成的叶片病斑大.此外，大豆疫霉的致病力从微观角度上与它和大豆的互作机制紧密相关[9-10]；如大豆疫霉致病基因的表达以及其分泌的效应分子压制大豆疫霉的防卫反应等等[3,15].

图4 不同菌株大豆疫霉的生长速率 Fig.4 Growth rates of different strains of Phytophthora sojae注:分别表示与模式菌株p6497相比,生长速率在(p<0.05;p<0.01)下有差异,下同.图5 不同菌株大豆疫霉的致病力Fig.5 Pathogenicity of different strains of Phytophthora sojae

2.5 大豆疫霉致病基因的表达

为进一步探讨5株大豆疫霉致病力存在差异的原因，我们对文献报道的10个大豆疫霉致病基因[17-22]的表达量进行了检测，结果如图6所示.与大豆疫霉致病力相关的基因PsAAT3、PsFRD、PsDHB、PsDHA、PsGcn5、PsCHS1、PsIMPA1、PsMPK1和PsYKT6在强致病力组菌株BB8和BZ1中的相对表达量>1.0出现不同程度的上调表达，例如在菌株BB8和BZ1中基因PsDHB的相对表达量分别为4.1和3.1.中等致病力菌株FY8的致病基因的表达量在1.0左右，而在弱致病力组菌株SZ2和BZ9中10个致病基因相对表达量均<1.0.结果显示大豆疫霉致病力的差异与致病力基因的表达水平基本呈正相关性，这样的推测与文献报道一致[17-19].WANG等人[17]研究显示大豆疫霉天门冬氨酸转氨酶PsAAT3与氮元利用紧密相关，该基因在侵染阶段上调表达沉默PsAAT3会降低大豆疫霉的致病力和生长速率.与大豆疫霉能量代谢的一些基因如延胡索酸还原酶编码基因PsFRD、琥珀酸脱氢酶编码基因PsDHB和PsDHA与大豆疫霉的生长和致病力相关它们下调表达会影响大豆疫霉的生长和侵染过程[5,18].王源超教授课题报道组蛋白乙酰转移酶编码基因PsGcn5、丝裂原活化蛋白激酶编码基因PsMPK1和G蛋白家族基因PsYKT6均不同程度的参与了大豆疫霉的生长和侵染调控过程，对大豆疫霉的致病力有着明显的影响[19,22].PsCHS1参与疫霉细胞壁几丁质合成酶的翻译，在大豆疫霉的侵染过程中发挥着重要作用，其表达量与致病力成正相关关系[20].大豆疫霉锌指转录因子PsCZF1参与调控大豆疫霉生活史的多个阶段，例如生长、卵孢子形成、游动孢子释放和休止孢萌发.该基因正常表达对大豆疫霉的侵染是十分必要的[15].

图6 不同菌株大豆疫霉致病基因的表达Fig.6 Expression of pathogenic genes in different strains of Phytophthora sojae

3 结论

本文从被侵染的大豆根茎及土壤中分离了5株病原菌，经形态学和分子生物学技术鉴定它们为大豆疫霉.试验结果显示5株大豆疫霉菌的生长速率和致病力存在差异，其致病力与生长速率和致病基因的表达成正相关关系.