异常凝血酶原在肝细胞肝癌诊断中的临床价值

柯建飞 项国谦

肝细胞肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是指由肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，死亡率高[1]。肝细胞肝癌的病因和发病机理尚未明确，起病隐匿，病情发展迅速，早期手术切除是最有效的治疗方法[1-2]。异常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）是指由于维生素K 缺乏或者由于服用维生素K 拮抗剂而产生的异常蛋白质。PIVKA-Ⅱ是凝血Ⅱ因子（凝血酶原）的PIVKA体，因此也被称为异常凝血酶原。PIVKA-Ⅱ可出现在维生素K 缺乏或肝细胞肝癌患者的血清中，是诊断肝细胞肝癌的另一个重要指标，可与血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）互为补充。正常个体中无PIVKA-Ⅱ，但在肝病和肝细胞肝癌患者中即便未出现维生素K 缺乏，也可能存在PIVKA-Ⅱ。近年来，多数学者主张采取PIVKA-Ⅱ联合AFP 检测的方式诊断早期肝细胞肝癌[3-6]，大大提高了早期肝细胞肝癌的检出率。本文探讨PIVKA-Ⅱ在肝细胞肝癌中的诊断价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2020 年11 月至2021 年3 月在浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院确诊的肝细胞肝癌患者45 例，肝硬化患者36 例。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。肝细胞肝癌病例诊断符合《原发性肝癌诊疗规范（2019 年版）》诊断标准，肝硬化病例诊断符合2010 年中华医学会肝病学分会、感染分会制订的《病毒性肝炎防治指南》中关于病毒性肝炎的诊断标准。所有病例均无维生素K 缺乏、无自身免疫性疾病及血液系统疾病，均未服用维生素K 及维生素K 拮抗剂类药物。同时选取同时期健康体检者40 例作为对照组。本研究通过医院伦理审查，伦理编号：ZN-20220401-0056-01。

1.2 仪器与试剂 PIVKA-Ⅱ采用美国雅培公司提供的ARCHITECT i2000 全自动免疫分析仪及配套异常凝血酶原测定试剂盒进行检测（试剂批号：26891LP30）。AFP 采用美国雅培公司提供的ARCHITECT i4000SR 全自动免疫分析仪及配套试剂盒进行检测（试剂批号：29510FN00）。

1.3 样本采集 按照要求，静脉穿刺采取三组研究对象促凝血5 mL。静置10 min，3000 r/min 离心10 min，观察血清无溶血。将澄清样本转移至样品杯或新试管中，以备检测。

1.4 PIVKA-Ⅱ检测 异常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）采用两步法免疫检测，运用Chemiflex 技术，即CMIA技术与灵活的检测模式的结合，定量检测人血清PIVKA-Ⅱ。（1）混合样本、稀释液和PIVKA-Ⅱ抗体包被的顺磁性微粒子。样本中的PIVKA-Ⅱ与PIVKA-Ⅱ抗体包被的微粒子相结合。（2）冲洗后进入第二步，加入吖啶酯标记的凝血酶原抗体结合物，形成反应混合物。（3）再次冲洗后，将预激发液和激发液加入到反应混合物中。（4）测量产生的化学发光反应，以相对发光单位（RLU）表示。样本中的PIVKA-Ⅱ含量与发光系统检测到的RLU 值之间成正比。血清PIVKA-Ⅱ的参考区间为≤40 mAU/mL。

1.5 AFP 检测 AFP 检测采用直接化学发光技术的双抗体夹心法。（1）分配10 μL 样品到比色杯内。（2）分配50 μL 标记试剂和250 μL 固相试剂，在37 ℃条件下孵育7.5 min。（3）分离、吸出未结合试剂，然后用试剂水洗涤比色杯。（4）配制酸性试剂和碱性试剂各300 μL，启动化学发光反应。测量产生的化学发光反应，以相对发光单位（RLU）表示。样本中的AFP 含量与发光系统检测到的RLU 值之间存在正比关系。血清AFP 的参考区间为≤20 ng/mL。

1.6 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件进行统计分析，所有数据均进行正态性检验及方差齐性检验，正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析，两变量之间行相关分析。使用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清PIVKA-Ⅱ和AFP 的诊断效能。计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组研究对象一般资料比较 肝细胞肝癌组45 例，年龄（59.75±11.41）岁，男34 例（76%），女11例（24%）；肝硬化组36 例，年龄（64.05±7.62）岁，男25 例（69%），女11 例（31%）；对照组40 例，年龄（58.60±14.15）岁，男28 例（70%），女12 例（30%）。三组研究对象年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 不同组别血清PIVKA-Ⅱ、AFP 水平比较 肝细胞肝癌组血清PIVKA-Ⅱ水平明显高于肝硬化组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。肝硬化组和对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。三组之间AFP 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组血清PIVKA-Ⅱ表达水平比较（）

表1 各组血清PIVKA-Ⅱ表达水平比较（）

注：PIVKA-Ⅱ为异常凝血酶原；AFP 为甲胎蛋白；与肝硬化组、对照组比较，aP＜0.05

2.3 PIVKA-Ⅱ、AFP 单独和联合检测对肝细胞肝癌诊断效能分析 PIVKA-Ⅱ和AFP 单独检测的敏感性明显低于PIVKA-II+AFP 联合检测，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 血清PIVKA-Ⅱ、AFP 单独检测和联合检测对原发性肝癌诊断效能（%）

2.4 PIVKA-Ⅱ、AFP 单独和联合检测肝细胞肝癌时ROC 曲线分析 PIVKA-Ⅱ临界值为47.715 mAU/mL时，诊断肝细胞肝癌的曲线下面积为0.884；AFP 临界值为4.35 μg/L 时，诊断肝细胞肝癌的曲线下面积为0.787；PIVKA-Ⅱ+AFP 联合检测时ROC 曲线下面积为0.901，PIVKA-Ⅱ、AFP 单独检测分别与PIVKA-Ⅱ+AFP 联合检测曲线下面积比较，差异均有统计学意义（P 均＜0.05），见图1。

图1 PIVKA-Ⅱ、AFP 单独和联合检测原发性肝癌时ROC 曲线

2.5 各组PIVKA-Ⅱ、AFP 检测结果阳性率比较肝细胞肝癌组血清PIVKA-II 或AFP 检测结果阳性率为71.1%（32/45），肝硬化组为11.1%（4/36），对照组为17.5%（7/40），三组数据总体均数存在着统计差异（χ2=39.92，P＜0.001）。肝细胞肝癌组与肝硬化组、对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），肝硬化组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组血清PIVKA-Ⅱ、AFP 检测结果阳性率比较[例（%）]

3 讨论

肝细胞肝癌是常见的恶性肿瘤，其死亡率高居所有肿瘤死亡率第二位[7-8]。其原因除了缺乏有效的治疗方式外，更重要的是肝细胞肝癌早期无明显的症状，发现时大多已是晚期。肝细胞肝癌晚期的治疗方式有限、治疗效果也不理想。目前常用的肝癌检测方法包括超声检查结合血清标志物AFP 测定，但是二者均有不足。超声检查不易发现早期肝癌。血清标志物AFP 是目前最常用的肝癌标志物，但其易受到肝硬化、梗阻性胆道系统疾病等影响。同时AFP 可以在多种肿瘤中表现出较高的浓度，因此它在诊断早期肝癌时的特异性和灵敏性都不理想，漏诊率也较高，也无法进行治疗后的疗效判断[9-10]。

PIVKA-Ⅱ是维生素K 缺乏或采用华法林或苯丙香豆素进行治疗的患者中的一种异常脱羧基凝血酶原（DCP）。由于PCP 不能通过结合钙离子与磷脂联结，因此存在功能缺陷。PIVKA 测量可在常规凝血试验结果变化前或出血前便检出维生素K 缺乏。正常个体中无PIVKA-Ⅱ，但肝病和肝脏恶性肿瘤患者中即便未出现维生素K 缺乏，也可能存在PIVKA-Ⅱ[11]。多项研究表明，PIVKA-Ⅱ对诊断肝细胞肝癌的特异性高于AFP，能明显提高肝细胞肝癌的检出率，达到早发现早治疗的目标。Parameter、APASL 和JSH等权威指南和共识都推荐将PIVKA-Ⅱ作为肝细胞肝癌筛查、辅助诊断及预后判断的重要指标。亚太肝病学会及日本肝病学会推荐将其用于高危人群的筛查、肝病的辅助诊断、治疗效果的监测和预后复发的预测工具。中华医学会肝病学分会最新发布的《慢性乙肝防治指南》，也推荐使用PIVKA-Ⅱ，与AFP 互为补充，提高肝细胞肝癌的早期诊断率。同时肝癌的早发现也极大的提高了其疾病的预后，提高了肝癌患者生活质量。

本研究发现，PIVKA-Ⅱ既可辅助诊断肝细胞肝癌，也可用于肝细胞肝癌和肝硬化的鉴别诊断，降低肝癌的误诊率和漏诊率。PIVKA-Ⅱ水平弥补了AFP特异性差的缺陷，为临床诊断HCC 提供了新的高特异性的血清学指标。而PIVKA-Ⅱ和AFP 联合检测可提高HCC 检出的敏感性，有助于肝癌的及早发现。且血清PIVKA-Ⅱ水平能提示肝细胞肝癌的严重程度，为临床早期诊断提供强有力的支撑条件[12-15]。

综上所述，PIVKA-Ⅱ不仅有较高的特异性，还可用于肝细胞肝癌和肝硬化的鉴别诊断。通过ROC曲线发现，PIVKA-Ⅱ和AFP 联合检测肝细胞肝癌的敏感性远大于单独检测，可大幅提升早期肝细胞肝癌的诊断效能。同时也可为肝癌的早期诊断提供新的思路和方向，为患者争取更多的治疗方法和治疗时间。本研究由于入选患者不多，样本量不足，后期还需更多的实验数据予以证实。