基于PKA 依赖cAMP 信号介导肺胃SP 表达探讨中医肺胃相关理论的机制研究

晏露宁 汝触会 陈爱凤 陈 晔 韩佳颖 何 飞

脏腑同治是中医脏腑相关理论在长期实践中形成的临床经验，根据脏腑之间有无经络属络的关系分为有表里关系的脏腑同治和非表里关系的脏腑同治。仲景有云：“阳明病，脉浮……宜麻黄汤。”在这里，虽是阳明经表受邪，但仍会导致肺气不利，肺气不宣，故宣肺解表以麻黄汤治之，这是肺胃相关及肺胃同治理论在临床上的典型应用。本课题组前期研究已证明，通过食管内灌注盐酸可以诱导大鼠产生气道神经源性炎症改变，支气管-食管反射通路可以导致P 物质（substance P，SP）的表达发生改变，提示SP 可能是中医肺胃相关理论的基础之一，但SP 表达调控的机制仍不明确[1]。本研究旨在从蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）依赖环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号介导肺胃SP表达进一步探讨胃食管反流模型大鼠肺、胃组织中SP 的相关性及其可能的机制，为中医“肺胃相关”及“肺胃同治”理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF 级雄性6～8 周龄SD 大鼠12 只，体质量200～230 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证编号：20170005028404，许可证编号：SCXK（沪）2017-0005。实验动物饲养于浙江中医药大学SPF 级动物房，饲养条件：恒温，温度（22±2）℃，湿度50%～60%，光照12 h 明暗交替，换风次数15～20 次/h。本研究经过浙江中医药大学实验管理与伦理委员会审核通过（审批号：ZSLL-2020-205），实验动物的处置严格遵守浙江中医药大学动物实验中心的伦理相关规定进行。

1.2 试剂 二甲苯（国药有限公司，批号MD911521）；PBS 磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.4）（MDL 公司，批号MD911705）；苏木素染液（MDL 公司，批号MD911467）；DAB kit（MDL 公司，批号MD912068）；Anti-PKA beta（catalytic subunit）抗体（美国Abcam 公司，批号ab187515）；Anti-cAMP 蛋白Kinase Catalytic subunit抗体（美国Abcam 公司，批号ab26322）；Anti-SP 抗体（美国Abcam 公司，批号ab14184）。

1.3 仪器 全自动脱水机（德国徕卡公司，型号：ASP200S）；石蜡切片机（德国徕卡公司，型号：RM2235）；低温高速离心机（美国Thermo 公司，型号：Micro17R）；电泳仪（中国天能公司，型号：EPS300）；电泳槽（中国天能公司，型号：VE180C）；转膜仪（中国天能公司，型号：VE186）；石蜡加热包埋系统（德国Leica 公司，型号：G1150H）；加热磁力搅拌器（KyLin-Bell Lab Instruments 公司，型号：GL-5250A）；正置荧光显微镜（德国徕卡公司，型号：DM3000）；成像系统（日本尼康公司，型号：Nikon DS-U3）。

1.4 分组及造模 将12 只大鼠随机数字表法分为两组，即正常对照组、模型组，每组6 只。将腹腔麻醉后的大鼠取仰卧位固定，经口插入胃管至大鼠食管的中下段，模型组以8 滴/min 的速率缓慢灌注0.1 mmol/L 盐酸溶液，每次20 min，1 次/d，连续14 d。正常对照组用PBS 代替盐酸，方法与模型组相同。

1.5 标本采集 腹腔注射麻醉大鼠后心脏穿刺放血处死大鼠，经左心室插入导管至主动脉，含1%肝素的生理盐水快速冲洗后用4%多聚甲醛200 mL 灌流固定。立即在冰块上取出食管、肺及胃组织，包埋，恒冷箱冰冻切片，HE 染色。

1.5 观察指标及测定

1.5.1 光镜下观察肺胃组织学变化 对HE 切片进行图像的采集和分析：通过显微镜拍照（100 倍和200 倍镜下观察），采集分析样本相关部位，并进行HE 半定量分析：食管炎病理分级采用中华医学会消化内镜学会颁布的反流性食管炎诊断标准[2]，气道炎症病理分级采取半定量方法评估细支气管气道炎症[3]，胃黏膜炎症程度是根据黏膜中慢性炎症细胞的多少进行评分[4]。

1.5.2 免疫组织化学测定豚鼠肺及胃组织PKA、cAMP、SP 表达 大鼠肺、食管与胃组织分别置入10%中性甲醛中固定，取材包埋，石蜡包埋切片。石蜡切片脱蜡后行抗原修复，然后行免疫杂交。免疫杂交：3% H2O2孵育，PBS 冲洗，滴封闭液，室温30 min（湿盒中）。用滤纸擦去，不要洗。滴加适宜浓度的PKA、cAMP 与SP 一抗（均1∶50），孵育过夜，PBS 洗去，擦去PBS。滴加生物素化二抗，室温孵育，PBS 洗去二抗，擦去PBS。滴加工作液，室温孵育，PBS 洗去，擦去PBS。显色剂显色，自来水冲洗。苏木素复染，脱水，透明，封片后显微镜下观察并测定平均光密度。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，所有数据均符合正态分布，计量资料以均值±标准差（）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义；组间两两比较，方差齐性者采用两独立样本t 检验，方差不齐者采用Kruskal-Wallis H 检验，将“胃组织的PKA、SP 含量”与“肺组织的PKA、SP 含量”进行χ2检验和线性回归分析。

2 结果

2.1 各组大鼠肺、食管、胃组织病理形态学变化以及各组大鼠肺、食管、胃组织HE 半定量分析 与正常对照组比较，模型组肺、胃及食管组织半定量评分显著升高（P＜0.01）（见表1）；正常对照组大鼠肺组织肺泡大小正常，未见炎性细胞浸润，模型组大鼠肺组织可见大量的炎细胞浸润。正常对照组大鼠胃组织胃黏膜上皮光滑，未见炎细胞浸润。模型组大鼠胃组织胃黏膜上皮出现胃黏膜下间质水肿、黏膜下可见炎细胞浸润。正常对照组大鼠食管组织各层结构完整，黏膜厚薄适中，黏膜基底膜清楚，各层细胞排列整齐。模型组大鼠食管组织黏膜层增厚，基底细胞层及棘细胞层细胞数目增多，角化层增厚，局部黏膜基底细胞层明显增生，部分黏膜组织向外呈乳头样突起。见图1。

图1 各组大鼠肺、食管、胃组织形态学变化（HE 染色，200倍）

表1 各组大鼠肺、食管、胃组织HE 半定量分析（分，）

表1 各组大鼠肺、食管、胃组织HE 半定量分析（分，）

注：模型组予盐酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常对照组用PBS代替盐酸灌注；与正常对照组比较，aP＜0.01

2.2 各组大鼠肺、食管、胃组织PKA、cAMP 与SP 的表达情况 免疫组化结果表明，与正常对照组比较，模型组大鼠肺、食管与胃组织中PKA、cAMP 与SP的蛋白表达量均显著升高（P＜0.01）。见表2-4。

表2 各组大鼠肺、胃、食管组织PKA 蛋白表达量比较（）

表2 各组大鼠肺、胃、食管组织PKA 蛋白表达量比较（）

注：模型组予盐酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常对照组用PBS代替盐酸灌注；PKA 为蛋白激酶A；与正常对照组比较，aP＜0.01

表3 各组大鼠肺、胃、食管组织cAMP 蛋白表达量比较（）

表3 各组大鼠肺、胃、食管组织cAMP 蛋白表达量比较（）

注：模型组予盐酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常对照组用PBS代替盐酸灌注；cAMP 为环磷酸腺苷；与正常对照组比较，aP＜0.01

表4 各组大鼠肺、胃、食管组织SP 蛋白表达量比较（）

表4 各组大鼠肺、胃、食管组织SP 蛋白表达量比较（）

注：模型组予盐酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常对照组用PBS代替盐酸灌注；SP 为P 物质；与正常对照组比较，aP＜0.01

图2 各组大鼠肺、食管、胃组织中PKA、CAMP、SP 表达情况（苏木素染色，×400）

2.3 模型组大鼠肺、食管、胃组织PKA、SP 的相关性分析 以胃组织PKA 含量为自变量X，以肺组织PKA 含量为因变量Y，P＜0.05，说明因果关系成立，根据现有的数据寻找最能反映XY 关系的方程为：Y=0.073+0.639X（见表5）。回归分析结果表明：肺组织中PKA 的含量随胃组织PKA 含量的增加而增加。

以胃组织SP 含量为自变量X，以肺组织SP 含量为因变量Y，P＜0.05，说明因果关系成立，根据现有的数据寻找最能反映XY 关系的方程为：Y=0.107+0.321X（见表5）。回归分析结果表明：肺组织中SP 的含量随胃组织SP 含量的增加而增加。

表5 肺、胃组织PKA 与SP 含量线性回归分析

图3 肺胃组织SP 关系散点图

图4 肺胃组织PKA 关系散点图

3 讨论

胃食管反流引起的咳嗽是呼吸科常见病，属于胃食管反流病的范畴[5]。可归于中医的“胃咳”“内伤咳嗽”等范畴，病位在肺、胃。中医从肃肺和胃、疏肝和胃等角度入手治疗取得了良好的效果[6]。

SP 是速激肽家族的成员之一，SP 通过与受体相结合的方式在神经系统、免疫系统等多种组织器官发挥作用。既往研究表明，SP 是一种诱导迷走神经相关的支气管-食管反射通路的神经肽[7]，本课题组前期研究发现在胃食管反流大鼠模型的肺胃组织中SP 的表达含量高于正常组大鼠，可能是脏腑同治学说中肺胃相关理论的物质基础，而P 物质参与调控的机制则需要进一步研究[1]。

在神经-内分泌-免疫网络提出之后，越来越多的疾病被发现可能通过神经-内分泌-免疫网络的机制调控，如胃肠道疾病[7]、糖尿病[8]等。肺组织的神经内分泌细胞被研究证实会促进肺部组织释放神经肽、神经递质和促进哮喘对过敏原的反应。在发育性和慢性肺部疾病中起作用，也是小细胞肺癌的起源细胞[9]。PKA、cAMP、SP 在这一网络的信号传递中可能起到了重要的作用。cAMP 主要是由腺苷酸环化酶催化ATP 反应生成，而cAMP 对细胞的调节功能主要是通过激活PKA 来实现的。研究发现，激活后的PKA/cAMP信号通路，能够促进下游靶蛋白磷酸化，促使TRPV1通道开放，Na+、Ca2+等阳离子内流增加，从而促进SP的释放[10]。我们猜测这一通路在促进胃肠道组织释放SP 的同时，可能在气管、肺等组织中也发生了某些改变。因此本课题通过构建胃食管反流模型的大鼠，用免疫组化法测定肺、胃组织PKA、cAMP、SP 表达，并将结果进行相关性分析。研究结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠肺、食管与胃组织PKA、cAMP 与SP 蛋白表达量均极显著升高（P＜0.01）。相关性分析结果表明，直线回归方程能够较好地反映PKA 和SP 在肺胃表达中存在相关性，肺组织SP 的含量随着胃组织SP 的含量的增加而增加，肺组织PKA 的含量随胃组织PKA 的含量增加而增加。由此我们推断，在胃食管反流模型大鼠体内，PKA/cAMP 信号通路开放，从而使肺胃组织释放神经肽类SP，这或许能够从实验层面为中医肺胃相关及肺胃同治理论提供基础。本课题拟下一步从治疗干预角度设计研究，进一步证实PKA 依赖cAMP 信号介导肺胃SP 表达的相关情况。