基于网络药理学和分子对接研究颐脑解郁方治疗抑郁症的作用机制

李 玮 张慧和 朱政羽 赵 娜

抑郁症临床可见情绪低落、悲观消极甚至更有自杀倾向和行为，常伴有躯体化症状，如头晕头痛、胸闷气短、胃肠道不适、四肢乏力麻木等。调查显示，全球抑郁症患者约3.4 亿人，而我国患有抑郁症人数已达2600 万，引发自残、自杀风险较高，大学生抑郁症复发率也逐年增加[1-2]。目前单胺氧化酶抑制剂、三环类抗抑郁药物和第二代抗抑郁药物等西药均对改善抑郁症状有显著效果，但不良反应较大[3]。中医药治疗抑郁症具有减轻西药不良反应、综合调理等优势，临床可根据辨证分型选择方药。颐脑解郁方由柴胡、郁金、槲寄生、百合、五味子、白芍组成，具有疏肝解郁、调畅情志作用，可以改善抑郁症患者血清多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素含量，从而改善抑郁症，但其具体作用机制仍不明确[4-5]。近年来，网络药理学为中医药治疗疾病研究提供了很多新的依据，备受关注，其结合系统生物学信息，进行严谨的网络分析，并进行交集选取靶点，进一步分析出中药治疗疾病的相关信号通路。分子对接是对药物的受体和药物分子之间的分子结合模式以及亲和力进行模拟分析，是计算机时代辅助药物研究的一种新型研究方式。本研究借助网络药理学及分子对接技术探讨颐脑解郁方治疗抑郁症的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 颐脑解郁方活性成分获取 利用TCMSP 数据库（https://tcmsp -e.com/）、Symmap 数据库（www.symmap.org/search/）检索颐脑解郁方各个中药的化合物，口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为条件筛选颐脑解郁方的活性成分，并通过文献检索对虽不满足上述条件，但却有明显药效作用或中药含量较多的活性成分予以补充。

1.2 颐脑解郁方活性成分靶点预测 通过TCMSP（https://tcmsp-e.com/）、Uniprot（https://www.uniprot.org/）、Symmap 数据库（www.symmap.org/search/）网站将1.1筛选出的活性成分进行活性成分靶点预测。

1.3 抑郁症相关靶点搜集 通过检索GeneCard（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、pharmgkb（https://www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.org/）数据库关键词为“Depression（抑郁症）”，为提高结果的可信度GeneCards 选择Relevance score≥5 的结果。将1.2 获取的颐脑解郁方活性成分靶点与抑郁症相关靶点取交集，取交集的靶点作为颐脑解郁方治疗抑郁症的潜在靶点。

1.4 蛋白互作网络的构建 使用STRING 数据库（https://www.string-db.org/）构建蛋白互作网络（protein-protein interaction network，PPI），在“multiple protein”栏目输入颐脑解郁方治疗抑郁症的潜在靶点，物种设定为“Homo sapiens”，置信度选择“high confidence（0.700）”，获取颐脑解郁方疗效相关PPI网络，并将此网络导入Cytoscape 进行可视化，采用插件CytoNCA 筛选关键基因。

1.5 功能富集分析 利用RStudio 进行GO 和KEGG 通路富集分析，选用R 包“clusterProfiler”[6]，设定P-value＜0.01，并通过“ggplot2”包对显著富集结果进行作图。

1.6 分子对接 将关键靶点及其对应的化合物进行分子对接实验，验证其相互作用活性，对接软件选择AutoDock Vina。蛋白质晶体结构从RCSB PDB 数据库（https://www1.rcsb.org/）下载，化合物从Uniport 数据库下载。利用AutoDock Tools 对蛋白质晶体和化合物结构进行处理，包括分离蛋白质结构和原始配体、去除水分子和为结构加电荷，转换成“PDBQT”格式，利用Vina 软件完成分子对接，提取对接结果，并使用Pymol 软件对结合能力较强的结合模式进行作图。

2 结果

2.1 颐脑解郁方中药活性成分搜集结果 将颐脑解郁方各个中药组成进行分析，对比相应的活性化合物，共获取颐脑解郁方活性化合物72 个，其中柴胡17 个、郁金15 个、槲寄生7 个、百合7 个、五味子13个、白芍13 个。

2.2 颐脑解郁方活性成分靶点预测及抑郁症相关靶点搜集 经过详细的分析研究，共获得颐脑解郁方活性成分靶点1363 个，抑郁症相关靶点3236 个（见图1）。将颐脑解郁方活性成分靶点与抑郁症相关靶点取交集，作为颐脑解郁方治疗抑郁症的潜在作用靶点，共169 个（见图2），并绘制药物成分-靶点网络关系图（见图3）。

图1 抑郁症疾病靶点韦恩图

图2 颐脑解郁方与疾病靶点韦恩图

图3 药物成分-靶点网络图

2.3 蛋白互作网络的构建颐脑解郁方 使用STRING数据库构建核心治疗靶点的蛋白互作网络图（见图4）。图中169 个靶点存在3168 条相互作用。通过利用Cytoscape 中插件CytoNCA 筛选出网络中的重要节点13、37 和74 个，其中IL6、VEGFA、TNF 等18 节点的DC、CC 和BC 超过整个网络拓扑参数的平均值，说明TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、IL6、CASP3、JUN、PTGS2、TP53 这9 个靶点可能是颐脑解郁方治疗抑郁症的关键靶点（见图5）。

图4 蛋白互作网络图

图5 关键靶点筛选图

2.4 功能富集分析

2.4.1 GO 富集分析结果 经过GO 富集分析，共得到颐脑解郁方潜在治疗靶点的GO 条目2983 条，其中生物学过程（biological process，BP）2624 条、分子功能（molecular function，MF）243 条以及细胞组分（cellular component，CC）116 条，显著富集结果如图6、图7 所示。潜在治疗靶点涉及的BP 主要为炎症反应（inflammation）、氧化应激（oxidative stress）、脂多糖调节过程（lipopolysaccharide）等。

图6 GO 富集分析气泡图

图7 GO 富集分析柱状图

2.4.2 KEGG 富集分析结果 经过KEGG 富集分析，共得到颐脑解郁方潜在治疗靶点显著富集的KEGG 通路194 条（见图8、图9）。194 条显著富集的通路所涉及的生物过程主要包括免疫系统（immune system）、信号传导（signal transduction）、内分泌系统（endocrine system）等。其中有IL-17 信号通路、TNF信号通路等。

图8 KEGG 分析气泡图

图9 KEGG 分析柱状图

2.5 分子对接结果 将关键靶点及其对应的化合物进行分子对接实验，验证其相互作用活性，关键蛋白质与其对应的化合物的对接结果见表1；分子对接结果的平均结合能为-7.23 kcal/mol，低于-5 kcal/mol表明靶点蛋白和化合物具有较强的结合能力[7]。对接结合活性较强的结果进行对接模式分析，由下图可知，颐脑解郁方活性成分均深入活性位点，并与活性位点关键氨基酸残基形成极性或非极性键，以稳定配体和受体的结合。颐脑解郁方相互作用力分析结果显示颐脑解郁方的活性成分主要通过氢键、疏水作用、pi 相互作用及范德华力与关键靶点的活性位点相结合，见表1、图10。

图10 活性成分与靶蛋白分子对接图

表1 核心成分与核心靶点的分子对接（kcal/mol）

3 讨论

本研究基于网络药理学和分析对接对颐脑解郁方治疗抑郁症进行深入的分析和研究，通过TCMSP、Symmap 数据库分析及文献补充，共筛选出颐脑解郁方中药物的72 种活性成分，对应1363 个靶点。通过Cytoscape 中插件CytoNCA 的筛选，获得了颐脑解郁方治疗抑郁症关键靶点有9 个分别为TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、IL6、CASP3、JUN、PTGS2、TP53，其中IL6 是促炎细胞因子，其在抑郁症的发病机制过程中有着显著的作用[8]。MAPK3 是MAPK 信号通路中的一员，许多参与神经营养因子信号传导的关键基因均与MAPK 活性相关[9]。研究显示，抑郁患者血清中IL-6、TNF 水平与抑郁症严重程度呈正相关，其中TNF-α 拮抗剂可以通过调节MAPK 信号通路，从而引起各种抑郁症状[10]。TNF 为促炎细胞因子，它可激活IL-6 和TNF-α 等炎症细胞因子，还可调节MAPK 等基因，调节神经炎症反应及组织细胞重塑[11]。VEGFA 介导的血管生成，会加重炎症反应，并与抑郁严重程度成正相关[12]。有文献研究显示，靶基因TP53 在细胞周期阻滞、凋亡、衰老、DNA 修复以及细胞代谢等过程中起到相当重要的作用[13]。PTGS2 是前列腺素生物合成中的关键酶，既是一种双加氧酶又是一种过氧化物酶，是非甾体类药物的作用靶点之一，与炎症反应密切相关[14]。

颐脑解郁方疗效相关靶点的GO 分析结果显示，炎症反应、氧化应激、脂多糖等生物学过程显著富集，通过KEGG 富集分析，共筛选出30 条显著富集的分子通路，其中有IL-17 信号通路、TNF 信号通路等。这2 条信号通路主要是与炎症反应、细胞代谢密切相关[15]，结合上述的9 个靶点的分析，颐脑解郁方对抑郁症的作用机制可能是通过影响TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、IL6、CASP3、JUN、PTGS2、TP53因子的表达进一步影响抑郁症的炎症反应、细胞代谢等过程。

分子对接结果关键蛋白质与其对应的化合物显示，山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）与关键靶点PTGS2、TP53 具有较强的结合活性，说明这些中药化合物可能是颐脑解郁方发挥药效的关键组分。山柰酚具有抗抑郁的作用[16]。β-谷甾醇是一种植物甾醇，可以缓解小鼠抑郁行为[17]。本研究提示颐脑解郁方关键组分与PTGS2、TP53 等炎症因子对接紧密，提示山柰酚、β-谷甾醇等是颐脑解郁方抑制抑郁症炎症反应的主要中药化合物。图10 显示出了颐脑解郁方活性成分与靶蛋白分子活性位点相结合，目前针对中药化合物的研究较少，可以作为未来的研究方向。综上所述，中药化合物山柰酚、β-谷甾醇为颐脑解郁方治疗抑郁症的关键化合物。

因此，从网络药理学和分子对接的详细分析结果和数据网络图得知，颐脑解郁方可能通过多个中药化合物作用于多个分子靶点发挥其对抑郁症的治疗作用，其分子机制主要涉及抑制抑郁症炎症反应，减弱氧化应激等方面，此结果可以为颐脑解郁方治疗抑郁症提供一定的依据，但上述所得结果主要来源生物信息学数据库，存在一定的局限性，还需要进一步严谨的动物实验和临床试验进行验证。