基于网络药理学探讨运脾化浊膏干预代谢综合征的作用机制

林鹏展 金清龙 池美华

代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是一组以腹型肥胖、高血糖、高血压、血脂代谢异常、胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）为主要特征的代谢紊乱症候群，并能显著增高罹患心脑血管疾病及糖尿病等疾病的风险[1]。因生活方式与饮食习惯的改变，我国中老年人MS 患病率高达33.9%，并呈逐年上升趋势[2]。此外，肥胖儿童患MS 亦不在少数[3]。目前西医治疗MS 虽可采用干预生活方式并结合降糖、降压、降脂等手段，但临床疗效有限[4]。中医根据四诊合参辨证论治，整体调节个体气血阴阳，对改善MS 的症状及防治并发症有良好效果[5]。运脾化浊膏由国医大师王琦院士的体质膏方加减变化而来，具有健脾理气，利湿化浊的功效[6]。本文从网络药理学方向分析运脾化浊膏的药物活性成分、靶点与痰湿质MS 之间的作用关系，以期阐明其作用机制[7]。

1 材料与方法

1.1 数据来源网址及数据分析软件 中医药系统药理学平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、蛋白质数据库（Universal Protein，Uniprot）（https://www.uniprot.org/）、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）治疗靶标数据库（Therapeutic Target Database，TTD）数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM数据库）（http://www.omim.org）、Disgenet 数据库（https://www.disgenet.org/）、Draw Venn Diagram 平台（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）、STRING11.5 数据库（https://string-db.org）、Metascape平台（https://metascape.org/）、生物信息在线作图网站微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/）、Cytoscape 3.8.2 软件。

1.2 运脾化浊膏药物成分靶点筛选 运脾化浊膏成分为苍术、白术、厚朴、陈皮、姜半夏、茯苓、薏苡仁、炒白扁豆、瓜蒌、桔梗、大腹皮、枳壳、绞股蓝、太子参、砂仁、泽泻、木香、浙贝母、干姜。挖掘TCMSP 数据库，依据口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性（drug-likeness，DL）≥0.18[8]初步筛选出药物活性化合物及其作用的蛋白质靶点，将筛选出活性化合物靶点在Uniprot 蛋白质数据库中转化成规范化基因名称。

1.3 构建药物四气五味归经网络 通过Cytoscape 3.8.2 软件构建出药物的四气五味及归经的网络图，将药物四气五味导入软件并进行网络特征分析。

1.4 构建运脾化浊膏“药物-成分-作用靶点”网络通过Cytoscape3.8.2 软件构建运脾化浊膏“药物-成分-作用靶点”网络，将筛选出药物有效成分与作用靶点导入软件并以分析工具进行网络特征分析。

1.5 MS 疾病靶点筛选 设代谢综合征（Metabolic Syndrome）为关键词，挖掘GeneCards、TTD、OMIM、Disgenet 数据库等来获取其疾病潜在靶点，整理靶点合并并删除重复值后获得MS 的疾病靶点。

1.6 构建运脾化浊膏-MS 靶点PPI 网络 取运脾化浊膏与MS 两者靶点通过Draw Venn Diagram 平台绘制出韦恩图，在String11.5 平台中构建蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI），将物种限定为人，最低相互作用评分设置成最高置信度（0.900），构建出运脾化浊膏-MS 靶点PPI 网络，并在Cytoscape3.8.2 软件中进行优化与拓扑分析，预测关键靶点。

1.7 运脾化浊膏-MS 关键靶点GO、KEGG 分析 将已预测的关键靶点提交至Metascape 平台中进行基因本体（geno ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析通路富集分析，运用Cytoscape 3.8.2 软件构建运脾化浊膏-MS 关键靶点-通路网络图，并利用微生信平台绘制GO-BP 通路与KEGG 通路的条形图。

1.8 构建运脾化浊膏活性成分-重合靶点-MS-通路网络图 通过Cytoscape 3.8.2 构建出运脾化浊膏活性成分-重合靶点-MS-通路靶点网络图，利用“network analyzer”分析工具进行网络特征分析，节点程度以连接度值调节，连接度值越大表明其生物活性越高，功能越齐全，重要性越高。

2 结果

2.1 运脾化浊膏药物成分信息 挖掘TCMSP 数据库获得运脾化浊膏药物有效成分及作用靶点，其中苍术有效成分4 种，作用靶点57 个；白术有效成分7种，作用靶点20 个；厚朴有效成分2 种，作用靶点27个；陈皮有效成分5 种，作用靶点63 个；姜半夏有效成分12 种，作用靶点86 个；茯苓有效成分6 种，作用靶点19 个；薏苡仁有效成分6 种，作用靶点28个；炒白扁豆有效成分7 种，作用靶点68 个；瓜蒌有效成分10 种，作用靶点15 个；桔梗有效成分4 种，作用靶点66 个；大腹皮有效成分6 种，作用靶点25个；枳壳有效成分5 种，作用靶点85 个；绞股蓝有效成分14 种，作用靶点146 个；太子参有效成分6 种，作用靶点85 个；砂仁有效成分9 种，作用靶点49个；泽泻有效成分7 种，作用靶点5 个；木香有效成分5 种，作用靶点29 个；浙贝母有效成分5 种，作用靶点48 个；干姜有效成分5 种，作用靶点42 个；合并并删除重复值后可获得药物有效成分共99 个，作用靶点共261 个。其中β-谷固醇与豆甾醇为较多药物共有化合物。见表1。

表1 运脾化浊膏主要成分表

2.2 运脾化浊膏药物四气五味归经网络 将运脾化浊膏药物及其四气五味与归经导入Cytoscape3.8.2软件进行分析，构建运脾化浊膏“药物—四气”“药物-五味”“药物-归经”网络图见图1。全方药物四气以温性为主，占药物的47.36%，五味主要以辛甘苦味为主，占药物的94.73%，归经主归肺胃二经，占总药物的84.12%。

图1 “药物-四气”“药物-五味”“药物-归经”网络图

2.3 运脾化浊膏“药物-成分-作用”网络 将运脾化浊膏中99 个有效成分及261 个作用靶点导入Cytoscape3.8.2 软件进行分析，构建出运脾化浊膏“药物-成分-作用”网络图，图中节点表示靶点信息，边表示节点间的作用联系。网络图中共有379 个节点，1460 条边，其网络度中心性均值为5.97，介度中心性均值为5.60E-03，紧密中心度均值为0.29。见图2。

图2 运脾化浊膏“药物-成分-作用”网络图

2.4 MS 疾病靶点 通过挖掘Genecards 数据库可获得15716 个MS 疾病靶点，根据相关性得分由大致小进行排序，选取前八分之一的靶点作为目标靶点，可获得1964 个靶点，继续挖掘OMIM 数据库、Disgenet 数据库与TTD 数据库补充相关靶点，共获得MS 疾病靶点2464 个。

2.5 运脾化浊膏-MS 靶点PPI 网络 将运脾化浊膏与MS 获得靶点通过Draw Venn Diagram 平台绘制出韦恩图（见图3），可见两者共存126 个共同靶点，通过String11.5 平台构建出PPI 网络图（见图4），本研究置信度设为0.900，并隐藏断开连接节，该网络图中可视其PPI 中节点数为126，预期边数133，边数382，PPI 富集P 值为＜1.0e-16，平均节点数6.06，平均局部聚类系数0.344，于Cytoscape 3.8.2 软件中勾画网络图（见图5），经分析可知该网络度中心性均值为7.01，介度中心性均值1.85e-02，选取均大于均值的度中心性与介度中心性可筛选出26 个核心靶点（见表2），占共同靶点的20.63%

表2 核心靶点拓扑属性参数

图3 运脾化浊膏-MS 韦恩图

图4 运脾化浊膏-MS 靶点PPI 网络（1）

图5 运脾化浊膏-MS 靶点PPI 网络（2）

2.6 GO 与KEGG 通路分析 将核心靶点置于Metascape 数据库进行GO 及KEGG 通路富集分析，分析以P＜0.01 为标准，将P 值由小到大进行排序，选择前20 条GO 及KEGG 进行分析。通过Cytoscape 3.8.2 软件、生物信息在线作图网站微生信进行绘制其网络图与条形图，整理可获得图6、图7、表3。经分析，运脾化浊膏改善MS 的细胞成分主要为内质网内腔、膜筏、膜微区、囊腔、质膜蛋白复合物、小窝、质膜筏、分泌颗粒腔、胞质泡腔、血液微粒、主轴、RNA 聚合酶Ⅱ转录调节复合物、转录调节复合物、粘着斑、质膜的外在成分、细胞-基底连接、蛋白质DNA 复合物、胞体、细胞基部、膜侧等；生物过程主要涉及有机环化合物、生长因子、氧化应激、类固醇激素、激素刺激、细胞死亡、活性氧、无机物、脂质、DNA 结合转录因子活性、细胞程序性死亡等的反应；分子功能包括结合DNA 结合转录因子、磷酸酶、染色质、转录因子、、细胞因子受体、转录协同调节因子、一氧化氮合酶调节、核心启动子序列特异性DNA、蛋白激酶、蛋白质结构域特异性蛋白磷酸酶，并调节信号受体激活剂、受体-配体、核受体、配体激活转录因子等活性。KEGG 通路分析可视，其主要通路可能为AGERAGE 信号通路、IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路相关。

表3 KEGG 前20 条通路表

图6 富集分析通路条形图

图7 富集分析通路网络图

2.7 构建运脾化浊膏-MS-通路网络图 将运脾化浊膏药物成分，活性化合物、重合靶点、核心靶点，KEGG 通路信息通过Cytoscape 3.8.2 软件进行构建网络图（见图8）。

图8 运脾化浊膏-MS-通路网络图

3 讨论

MS 病情多样冗杂，常常以腹型肥胖、高血糖、高血压、血脂代谢异常、IR 为主要特征，MS 发病机制虽进行多方面的研究，目前仍未完全阐明。中医根据MS 的临床症状，将其归纳为“肥胖”“消渴”“眩晕”等诸证[9]，多由于患者饮食不节、安逸少动、情志失调或禀赋不足等，导致出现痰湿等病理产物，继而影响脾脏的生理功能[10]。脾者，后天之本也，主运化，运化失常无力输布水谷精微，则湿邪内生，痰浊内阻，痰湿与脾虚互相影响，表现为一系列MS 症状。王琦教授首次提出痰湿体质，并构建出痰湿体质理论体系[6]，并擅长以体质膏方调理MS 患者，运脾化浊膏为体质膏方改制而来。

本研究基于网络药理学预测运脾化浊膏治疗MS 的潜在机制。挖掘TCMSP 数据库获得药物有效成分99 种，作用靶点261 个，主要有效成分包括β-谷固醇与豆甾醇等；绘制出组成药物四气五味归经网络图，分析可知，全方以温性，辛甘苦味为主，主归脾胃二经；挖掘各项疾病数据库获得MS 靶点2464个，绘制出韦恩图获得交集靶点126 个。通过String11.5 数据库构建PPI，以Cytoscape 3.8.2 软件进行拓扑分析筛选出26 个核心靶点，占总靶点数的20.63%，关键靶点为TP53、AKT1、MAPK1、CTNNB1、TNF、ESR1、EGFR、CAV1、IL6、FOS、STAT1、AR、CASP3、IL10、IL4、INS、PPARA、F2、PLG、PPARGC1A、EDN1、FN1、NR3C1、PPARG、CASP8、IGFBP3。将核心靶点通过Metascape 数据库进行GO 及KEGG 分析，经分析，运脾化浊膏可通过结合DNA 结合转录因子、磷酸酶、染色质、转录因子、细胞因子受体、转录协同调节因子、一氧化氮合酶调节、核心启动子序列特异性DNA、蛋白激酶、蛋白质结构域特异性蛋白磷酸酶，并调节信号受体激活剂、受体-配体、核受体、配体激活转录因子等活性来改善MS 相关症状，及主要通路可能与AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、Toll样受体信号通路相关。

早在1988 年研究者已发现β-谷固醇具有降血糖与胰岛素释放的功效[11]。Cicero Arrigo 等[12]研究发现低剂量β-谷固醇可降低血脂水平，且安全性与有效性良好。Babu 等[13]研究发现，β-谷固醇是通过IRS-1/Akt 介导的胰岛素信号通路减轻胰岛素抵抗。近年来研究证实豆甾醇是通过抑制肠道相关转运蛋白表达[14]、抑制各项酶类活性[15]，增加胆固醇逆向转运相关转运蛋白[16]来提高胆固醇的排泄，并且通过干扰肠道脂肪酸吸收[17]、调节肝脏脂质代谢来降低三酰甘油的水平[18-19]。

金代医家张元素所著《医学启源》曰：“脾胃：味甘补，苦泻，气温热补，寒凉泻[20]。”又有《辅行决》言：“脾德在缓，故经云：以甘补之，辛泻之[21]。”性温善行气化湿又兼补脾，味苦则燥湿，味辛则发散湿邪，味甘则补脾，又走脾胃二经，因而本方可行健脾理气，利湿化浊之功。

根据GO 及KEGG 分析，运脾化浊膏可能是通过结合DNA 结合转录因子、磷酸酶、染色质、转录因子、细胞因子受体、转录协同调节因子、一氧化氮合酶调节、核心启动子序列特异性DNA、蛋白激酶、蛋白质结构域特异性蛋白磷酸酶，并调节信号受体激活剂、受体-配体、核受体、配体激活转录因子等活性来改善MS 相关症状，作用通路可能与AGE-RAGE信号通路、IL-17 信号通路、Toll 样受体信号通路相关。AGE-RAGE 信号通路与MS 息息相关，患者一旦发生胰岛素抵抗，则血糖升高，继而蛋白质、脂质等出现非酶糖基化，形成糖基化终末产物，通过与细胞膜上的晚期糖基化终末产物受体结合发挥生物效应[22]。研究表明IL-17 信号通路与胰岛素抵抗也存在相关性，并且对限制性肥胖相关性胰岛素抵抗与验证控制方面均有积极作用[23]。Toll 样受体2 作为一种识别受体，可通过识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式而启动机体的免疫防御反应同时引发炎症，与胰岛素抵抗的发生密切相关[24]。

综上所诉，本次网络药理学初步分析预测了运脾化浊膏治疗MS 的潜在机制，但后期仍需要分子层面及临床试验研究佐以验证，为其临床运用提供有效的理论依据。