七氟醚后处理对缺血再灌注大鼠心肌内质网应激反应的影响及可能机制

秦佳月 朱志鹏 周红梅 路 建 吴 城

研究表明，临床的各种心肌缺血再灌注损伤往往伴随着心肌细胞的内质网应激及凋亡的病理过程[1-3]。七氟醚适应性干预对重要的脏器缺血再灌注损伤具有一定保护作用，但是同时也带来了心脏之外的副作用[4-5]。例如可以诱发内质网应激引起幼脑发育障碍、细胞凋亡和学习记忆功能下降[6-7]。为了明确七氟醚是否是通过干预心肌细胞的内质网应激而调控MIRI，本研究对缺血再灌注模型大鼠采用七氟醚后处理，研究心肌内质网应激反应程度，探索可能的分子机制。

1 实验材料

1.1 动物 55 只SPF 级雌性SD 大鼠（10 周龄），体质量（250±17）g，购买于浙江省医学科学院，自由饮食，常规饲养于浙江大学医学院附属邵逸夫医院实验动物中心。实验动物使用许可证：SYXK（浙）2017-0006，实验动物生产许可证：SCXK（浙）2019-0002，实验动物合格证：20220209Aazz0100018463。

1.2 细胞 H9C2 大鼠胚胎心肌细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司（procell，批号KG444），传代小于2 代。

1.3 试剂与仪器 七氟醚购于上海恒瑞医药有限公司（批号16030731）。DMEM 培养基（gibco 公司，批号C11995500BT），胎牛血清（FBS，四季青公司，批号11011），青霉素/链霉素（P/S，gibco 公司，批号15140-12），胰蛋白酶（浦泰生物，批号9002-07-7），二甲基亚砜（DMSO，Gibco 公司，批号D12345），Trizol（美国Invitrogen 公司，批号15596026），乳酸脱氢酶（LDH）（南京建成生物工程研究所，批号A020-1），anti-GRP78 抗体（Abcam 公司，批号ab21685）、anti-CHOP 抗体（Abcam 公司,批号ab11419）；β-actin 单克隆抗体（华安生物，批号33036M），RNA 引物（擎科生物科技公司），逆转录和qPCR 试剂盒（南京诺唯赞公司，批号R223-01，Q311-02）。所用仪器主要有：CO2培养箱（美国Thermo 公司，HERACELL 240iC02），离心机（SorvMl STl6），酶标仪（Muhiskan GO），倒置荧光显微镜（德国Carl Zeiss 公司；Axio Vert.A1）；MIC-101 细胞缺氧装置（美国Billups-Rothenberg 公司，MIC-101），核酸蛋白定量检测仪（Eppendorf，Gemany），Western 电泳、转膜、发光和分析系统（北京六一仪器厂）。

2 实验方法

2.1 动物实验方案 模型组取大鼠25 只，随机数字表法分为对照组（sham）和2、4、6、8 h 缺血再灌注组（I/R），每组各5 只。麻醉后对照组大鼠行心脏左冠状动脉前降支放线，但是不结扎。I/R 组大鼠分别于结扎血管缺血30 min 之后进行再灌注2、4、6 和8 h，制造在体心脏左冠状动脉前降支结扎缺血再灌注动物模型，获取心肌损伤和内质网应激反应最理想模型参数；实验组取大鼠30 只，随机数字表法分为sham组、I/R 组、七氟醚后处理组（sevoP，分为2.5%、3.0%亚组）、4-苯基丁酸（4-PBA）复合七氟醚组（4-PBA+2.5%、3.0% sevoP 组），每组各5 只。sevoP 组大鼠于缺血完成后通过七氟醚挥发罐吸入七氟醚和氧气的混合气体，通过特异密封性的口罩置于大鼠口鼻，吸入相应浓度和时间后单纯氧气洗脱七氟醚5 min，松开结扎线至规定时间。4-PBA 干预组的大鼠在实验前进行4-PBA 腹腔注射（300 mg/kg，造模前1 h 给予），后进入实验程序。再灌注时间结束即刻处死大鼠，取颈动脉血，取心尖和心脏组织，检测内质网应激相关蛋白的蛋白、mRNA 表达（GRP78、CHOP）。

2.2 细胞模型及实验方案 H9C2 细胞放入DMEM培养基（含10%FBS 和1%P/S）于37 ℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养，过夜，当细胞铺满整个培养皿底面积达到80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，并按1∶3 进行传代或进行后续实验，传代不高于10 代。采用课题组前期的缺氧/复氧模型[8]，将H9C2 细胞培养至密度为70%左右，按细胞密度为4×105/mL 接种于6 孔板，每组3 个复孔，不含血清培养，放入含5%CO2，和95%N2密闭缺氧罐中缺氧3 h；之后由七氟醚挥发罐导入相应浓度的七氟醚30 min，最后换含10%胎牛血清的DMEM 培养液，常氧条件下培养3 h，对照组常氧条件下培养。siSERCA 引物设计由擎科生物公司设计，合成3 对引物（预实验中最有效的一对为：F，CCUCCUAGAAGGCCGAUACUU；R，AAGUAUCGGCCUUCUAGGAGG）和1 对ncSERCA 阴性对照，心肌细胞造模前48 h 进行siSERCA 基因敲低实验，敲低效率大于80%以上的细胞进入后续H/R 实验。

2.3 组织样本石蜡切片HE 染色 心脏组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。制作4 μm 厚的HE 石蜡切片，切片用苏木精和伊红（HE）染色，并进行倒置光学显微镜检查。另取样本脱水后用环氧树脂浸泡包埋，制作超薄切片，双重染色后置于H-600 透射电镜下观察。

2.4 LDH 和cTnI 浓度检测 每组5 只大鼠于不同再灌注结束时间点，CO2气体处死后取颈动脉血2 mL，3000 转离心10 min 后取上层血清。H9C2 细胞收集上清，12000 转离心5 min 备用。样本采用大鼠cTnI 和LDH 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒（RD 公司，美国），酶标仪上机测量450 nm 波长下的吸光度值进行分析。

2.5 RT-PCR 分析检测mRNA 表达 引物由擎科生物公司设计并合成，如下：GRP78 引物：正义链5'-AACCCAGATGAAACTGTAGCA-3'，反义链5'-ACATCAAGCAGAACCAGGTCAC-3'；CHOP 引物：正义链5'-AGCTGAGTCTCTGCCTTTCG-3'，反义链5'-TGTGGTCTCTACCTCCCTGG-3'；GAPDH 引物：正义链5'-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3'，反义链5'-CCAATATGATTCCACCCATG-3'。组织和细胞样本经各种处理后，按照RNA 提取试剂盒的步骤说明，以Trizol 法裂解细胞，之后转移至EP 管中离心，加入氯仿，放置、离心，分层后上层转移至有异丙醇的EP 管中，提取各组细胞总RNA，取沉淀溶于水中，分光光度计测定浓度，测定各组OD260/280,测定纯度，-80℃超低温冰箱储存。符合纯度的用反转录剂盒将1 μg RNA 反转录为cDNA，逆转录后的cDNA 各组分别取1 μL 在PCR 仪上进行扩增,设置一定的PCR反应条件变性、退火、延伸，观察溶解曲线。通过目的基因CT 值/内参GAPDH，计算出目的基因的相对表达。每组3 复孔，重复3 次。

2.6 Western blot 蛋白检测 组织和细胞经相应处理后，加入适量体积的蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解15 min，离心后取上清，直接用于SDS buffer 蛋白电泳上样或冻存于-80 ℃备用。利用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度，用酶标仪测定吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。根据分离胶的不同浓度参考目的蛋白分子量的大小，进行SDS-PAGE电泳。封胶、蛋白上样、调节电压开始电泳。接着备膜、切胶、装膜、转膜，脱脂牛奶封闭液中封闭，结合特异性一抗过夜、二抗孵育后，摇床上洗涤，进行ECL 化学发光曝光，拍照。以β-actin 为内参，各蛋白产物的相对表达量=蛋白产物电泳条带光密度值/βactin 产物电泳条带净光密度值。通过ImageProPlus软件对发光条带进行定量分析，记录各组数据后进行统计学分析。

2.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析和作图，计量资料以D'Agostino and Pearson omnibus 法作变量正态性分析，采用均数±标准差（）表示，组间数据比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey 法；非正态分布变量采用K-W 非参数检验。计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 内质网应激模型建立 sham 组大鼠缺血0.5 h后，外周血平均cTnI 浓度为（2.72±0.61）ng/mL，LDH浓度为（3.44±0.54）U/L，GRP78 相对表达量为（0.38±0.18），所有大鼠均存活。与sham 手术组比较，I/R 组的大鼠心肌损伤程度于缺血0.5 h 再灌注2 h 后明显增加，表现为血清LDH、cTnI 浓度的急剧升高（P＜0.05）；而不同模型中内质网应激分子伴侣GRP78 的表达显示，内质网应激反应直到缺血0.5 h 再灌注6 h后才表现明显，与sham 组比较，0.5/6 h 组和0.5/8 h模型组心肌组织GRP78 表达的显著增高（P＜0.05）。其中，0.5/6 h 模型组和0.5/8 h 模型组分别死亡大鼠1 只和2 只，差异无统计学意义（P＞0.05），后续将以0.5/6 h 为实验条件，见表1。

表1 不同条件下大鼠心肌缺血再灌注损伤程度和内质网应激变化

3.2 各组大鼠心肌病理形态改变 0.5/6 h 实验条件下大鼠心肌及心尖组织的HE 染色和电镜下形态改变显示（见图1）：与sham 组（图1a）相比，I/R 组（图1b）大鼠的心肌组织规则紊乱，断裂，水肿，心肌细胞坏死增多；电镜下sham 组（图1c）心肌细胞结构大致正常，I/R 组电镜下（图1d）的心肌纤维排列紊乱,细胞肿胀,细胞间边界模糊，心肌细胞呈现状坏死改变。

图1 sham 组和I/R 组大鼠心肌组织HE 染色情况和电镜下形态学改变

3.3 体内实验各组大鼠心肌组织GRP78、CHOP 基因和蛋白表达水平 与sham 组比较，I/R 组大鼠经历0.5/6 h I/R 后心肌组织的内质网应激分子伴侣GRP78、CHOP 的基因和蛋白显著高表达（P＜0.05）；与I/R 组比较，sevoP2.5、sevoP3.0 七氟醚后处理干预组大鼠心肌的内质网应激被有效抑制，表现在明显降低0.5/6 h 实验条件下产生的GRP78、CHOP 的mRNA 和蛋白高表达，其中2.5%与3.0%组间差异不明显（P＞0.05）；与sevoP2.5、sevoP3.0 比较，通过4-PBA 对内质网应激反应的抑制，4-PBA+sevoP2.5、4-PBA+sevoP3.0 组的GRP78、CHOP 表达被逆转，七氟醚的保护作用被削弱，表现为与sevoP2.5 或sevoP3.0组比较，4-PBA 干预组mRNA 表达显著增高，见表2、图2。

图2 七氟醚后处理对缺血再灌注大鼠心肌内质网应激的影响

表2 七氟醚后处理对大鼠心肌GRP78 和CHOP mRNA表达的影响（）

表2 七氟醚后处理对大鼠心肌GRP78 和CHOP mRNA表达的影响（）

注：sham 组大鼠麻醉后行心脏左冠状动脉前降支放线，但是不结扎；I/R 组大鼠于结扎血管缺血30 min 之后进行再灌注6 h，2.5%、3%sevoP 组动物在行微创左冠状动脉前降支结扎后即刻，吸入相应浓度的七氟醚15 min 后洗脱，4-PBA 干预组的大鼠在实验前进行4-PBA腹腔注射（300 mg/kg，造模前1 h 给予）；GRP78 为葡萄糖调节蛋白78；CHOP 为C/EBP 同源蛋白；与sham 比较，aP＜0.05；与H/R 组比较，bP＜0.05；与sevoP2.5 组比较，cP＜0.05；与sevoP3.0 组比较，dP＜0.05

3.4 体外实验各组大鼠心肌细胞GRP78、CHOP 基因和蛋白表达水平 与Control 组比较，3/3 h 的H/R损伤可能引起显著的细胞上清中LDH 浓度上升，以及细胞裂解成分的GRP78 和CHOP 蛋白表达显著升高（分别升高4.1 和4 倍），以2.5%七氟醚饱和后处理措施能够抑制过度的内质网应激[（GRP78：（2.46±0.50）比（1.52±0.38）；CHOP：（2.1±0.43）比（1.32±0.23），P＜0.05]，而给予心肌细胞SERCA 基因干扰后，能够体现出对H/R 内质网应激的应激逆转，与sevoP+H/R 组和siSERCA 阴性对照组相比，siSERCA+sevoP+H/R 组的GRP78 和CHOP 表达再度升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 七氟醚后处理对细胞GRP78 和CHOP 表达的影响（）

表3 七氟醚后处理对细胞GRP78 和CHOP 表达的影响（）

注：control 组的细胞常规培养，H/R 组细胞缺氧/复氧均3 h，sevoP 组复氧前以2.5%七氟醚处理缺氧箱内H9C2 细胞30 min，另两组H9C2细胞分别以小干扰肌浆网Ca2+-ATP 酶（siSERCA）和阴性对照（ncSERCA）处理48 h 后进行sevoP 同样的操作；LDH 为乳酸脱氢酶；GRP78 为葡萄糖调节蛋白78；CHOP 为C/EBP 同源蛋白；sevoP 为七氟醚后处理；H/R 为缺氧/复氧；ncSERCA 为阴性对照；siSERCA 为小干扰敲低SERCA；与control 组比较，aP＜0.05；与H/R 比较，bP＜0.05；与sevoP+H/R 组比较，cP＜0.05

4 讨论

缺血再灌注损伤是围手术期缺血性心脏病患者高死亡率、致病率的主要原因，虽然目前关于缺血再灌注损伤的机制已基本了解，但是仍然缺乏有效的干预手段。七氟醚是临床广泛使用的麻醉气体，其不同的适应性调控技术在心脏缺血再灌注损伤防控领域显示出一定的保护作用，但是也有一定的争议，具体机制未明。针对目前已有的内质网应激充分参与了心肌缺血再灌注损伤的生理病理进程这一共识[1，5，9]，本研究利用大鼠在体缺血再灌注损伤所致的内质网应激模型，阐明七氟醚对I/R-内质网应激的影响，再利用前期实验的H9C2 细胞缺氧3h/复氧3 h 模型，初步验证了七氟醚后处理通过调控内质网应激而保护缺血再灌注损伤的靶点。

心肌I/R 损伤可导致多种严重后果，其中最主要的是心肌梗死，因此本实验将检测LDH、cTnI 作为评价心肌I/R 损伤程度的金标准。而GRP78 是内质网应激特异性的标志分子，CHOP 是内质网应激凋亡通路的关键分子，组织和细胞在缺血缺氧后，引起ERS导致GRP78 的高表达，同时启动未折叠蛋白反应稳定内质网功能，保持细胞稳态，当内质网应激反应失控以后，心肌细胞通过CHOP 信号通路的激活，而产生细胞凋亡[10]。本研究选择这些指标能够反映心肌缺血再灌注损伤和内质网应激的变化情况，结果显示，H9C2 在3H/3R 条件下就会造成细胞损伤，心肌组织于缺血30 min 再灌注2 h 时刻即造成自心脏损伤，但是要产生显著的内质网应激变化，则需要在再灌注6 h 才有明显变化，猜想再灌注的损伤时间依赖性，这也间接印证了临床急性心梗解除的黄金6 h 原则，因为再灌注时间如超过6 h，由于自由基大量形成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸的释放等因素综合一起，组织和细胞的坏死在所难免。本研究没有采用大鼠langendroff 离体心脏灌注模型，旨在力求真实还原病理事件，模型结果同Huang 等[11]与Ding 等[12]的小鼠心肌缺血30min 再灌注6 h 的研究一致，此模型能够明显产生心肌的CK-MB、cTnI 高表达和细胞凋亡。

七氟醚适应性调控心脏缺血再灌注损伤已经被广泛研究，涉及到预处理、后处理、联合处理等方式。其中，后处理主要调控的通路包括线粒体通透性转换孔功能失调、心肌细胞凋亡等方面。除了七氟醚后处理抑制内质网应激在脑保护领域的贡献[13-14]，七氟醚后处理对心肌内质网应激的调控机制方面鲜有报道。Liu 等[5]报道指出七氟醚后处理对缺血再灌注损伤心肌内质网应激的调控是通过PERK/eIF2a/ATF4/CHOP 信号通路达到，靶点分子为Akt，不同于本研究中的靶点分子Ca2+-ATP 酶，但是结局指标均是相同的GRP78、CHOP 分子伴侣表达。

Ca2+-ATP 酶是细胞肌浆网中维持细胞内外Ca2+平衡的蛋白质，它能够分解ATP，维持细胞发挥正常功能时所需的钙浓度，尤其在能量供应缺乏情况下,钙泵失活致细胞内外浓度差紊乱，细胞内Ca2+浓度升高，最终引起钙超载，内质网应激反应的发生[15]。本研究发现，在心肌细胞H/R 模型的内质网应激条件下Ca2+-ATP 酶的敲低显著影响七氟醚的内质网应激调控作用，初步说明了七氟醚内质网应激调控的机制和靶标，研究结果与刘红超等[16]的七氟醚对糖尿病大鼠海马中Ca2+-ATP 酶活性的影响一致。至于七氟醚调控Ca2+-ATP 酶具体的信号通路和相互作用，有待进一步研究。

综上所述，本实验证实了七氟醚后处理可通过抑制内质网应激，从而减轻缺血再灌注心脏的损伤，其机制与心肌细胞Ca2+-ATP 酶的活性有关。